Mechanische Reize aktivieren die Genexpression über einen Signalweg zur Stresserkennung in der Zellhülle

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13979 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mechanosensitive Mechanismen werden häufig verwendet, um Schäden an der Gewebestruktur zu erkennen und die Matrixsynthese und -reparatur zu stimulieren. Während diese Art von mechanoregulatorischem Prozess in eukaryontischen Systemen gut bekannt ist, ist nicht bekannt, ob ein solcher Prozess bei Bakterien auftritt. Bei Vibrio cholerae führt eine durch Antibiotika verursachte Schädigung der tragenden Zellwand zu einer verstärkten Signalübertragung durch das Zweikomponentensystem VxrAB, das die Zellwandsynthese stimuliert. Hier zeigen wir, dass Änderungen der mechanischen Belastung innerhalb der Zellhülle ausreichen, um die VxrAB-Signalübertragung in Abwesenheit von Antibiotika zu stimulieren. Wir haben mechanische Kräfte auf einzelne Bakterien ausgeübt, indem wir drei unterschiedliche Beladungsmodalitäten genutzt haben: Extrusionsbeladung innerhalb eines Mikrofluidikgeräts, direkte Kompression und hydrostatischen Druck. In allen Fällen war die VxrAB-Signalübertragung, wie durch einen fluoreszierenden Proteinreporter angezeigt, in Zellen, die größeren mechanischen Belastungen ausgesetzt waren, erhöht, sodass verschiedene Formen mechanischer Reize die VxrAB-Signalisierung aktivieren. Die Verringerung der Zellhüllensteifigkeit nach der Entfernung der Endopeptidase ShyA führte zu einem starken Anstieg der Zellhüllenverformung und einer deutlich erhöhten VxrAB-Reaktion, was die Reaktionsfähigkeit von VxrAB weiter unterstützte. Unsere Ergebnisse zeigen ein mechanosensitives Genregulationssystem in Bakterien und legen nahe, dass mechanische Signale zur Regulierung der Zellwandhomöostase beitragen können.

Mechanische Kräfte gelten seit langem als Schlüsselfaktoren für das Wachstum und die Funktion von Organismen. In Säugetiersystemen regulieren mechanische Kräfte eine Vielzahl von Prozessen, darunter die Zelldifferenzierung während der Entwicklung1,2, die Entstehung und das Fortschreiten von Krankheiten3 sowie die Gewebehomöostase4. In Geweben und Organen mit tragenden Funktionen fungieren mechanische Kräfte oft als primäres Signal, das den Umbau und die Reparatur des Gewebes einleitet und es dem Gewebe dadurch ermöglicht, sich an die mechanischen Herausforderungen der Umgebung anzupassen und schnell wieder zur Belastung zurückzukehren. Der Gewebeumbau erhält dadurch die Homöostase der mechanischen Funktion aufrecht, indem er die Entfernung von beschädigtem Gewebe mit der Gewebesynthese in Einklang bringt. Tragende Strukturen wie Knochen5, Blutgefäße6 und das pflanzliche Zytoskelett7,8 nutzen mechanosensitive Mechanismen, um die mechanische Funktion aufrechtzuerhalten.

Die meisten Studien zur Mechanobiologie konzentrieren sich auf eukaryotische Systeme9, obwohl neuere Erkenntnisse die Bedeutung mechanischer Kräfte in Prokaryoten hervorgehoben haben. Bei Bakterien erstrecken sich extrazelluläre Anhängsel, darunter Flagellen und Typ-IV-Pili, vom Zellkörper, um mechanische Signale in der Umgebung wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Der Zusammenbau und die Demontage der Flagellenmotoreinheit reagieren auf Zunahmen und Abnahmen der externen mechanischen Belastung10,11. Die physikalische Hemmung der Flagellenrotation durch Kontakt mit einer Oberfläche erzeugt Reaktionskräfte innerhalb des molekularen Motors, die die Oberflächenadhäsion und die Biofilmbildung stimulieren12,13. Pili vom Typ IV sind motorisierte Fasern, die sich ausdehnen und zusammenziehen, um mit der Umgebung zu interagieren. Darüber hinaus fördert die Mechanosensorik durch Pili vom Typ IV die Biofilmbildung14 und die Freisetzung von Virulenzfaktoren15 und steuert die Motilität nach Kollisionen16.

Die Zellhülle ist der primäre tragende Bestandteil von Bakterien und reagiert auch empfindlich auf mechanische Kräfte. Durch Dehnung aktivierte Ionenkanäle innerhalb der Zellmembran reagieren schnell auf Änderungen der Osmolarität, indem sie sich aufgrund der Membrandehnung öffnen, was zu einer erhöhten Überlebensrate nach einem hypoosmotischen Schock führt17. Mechanische Belastungen und Belastungen innerhalb der Zellhülle wirken sich auch auf den Aufbau von Transhüllen-Effluxkomplexen aus. Beispielsweise wird der Aufbau und die Funktion der transhüllenden Mehrkomponenten-Effluxpumpe CusCBA durch einen Anstieg der oktaedrischen Scherspannung innerhalb der Zellhülle beeinträchtigt 18 . Mechanischer Stress innerhalb der Zellhülle wirkt sich auch auf die Stellen aus, an denen bei Bakterien, die einer Biegung ausgesetzt sind, eine neue Zellwand eingefügt wird, wobei in Bereichen mit größerer Zugspannung größere Mengen an Zellwand eingefügt werden19,20. Obwohl diese mechanosensitiven Mechanismen innerhalb der Zellhülle gut bekannt sind, wurde gezeigt, dass keiner der bisher identifizierten Mechanismen die Genexpression im Zusammenhang mit der Umgestaltung der Zellwand, einem wesentlichen Bestandteil der Zellhülle, reguliert. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Genregulationssysteme, die derzeit mit anderen Formen von Zellstress in Zusammenhang stehen, möglicherweise auch mechanosensitiv sind21, und ein aktueller Bericht legt nahe, dass die Eingrenzung die Rcs-Signalübertragung und die daraus resultierende Resistenz gegen Bakteriophagen in E. coli verstärkt22. Wenn mechanosensitive Mechanismen an der Umgestaltung und Homöostase der Zellhülle beteiligt sind, ist zu erwarten, dass mechanischer Stress und Belastung die Synthese von Komponenten der Zellhülle regulieren.

Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera-Erkrankung, überlebt schnelle Veränderungen der Osmolarität beim Übergang zwischen Süß- und Brackwasser, Meeresumgebungen und dem Darm eines Wirts. Osmolaritätsänderungen führen zu Turgorschwankungen, die die mechanische Spannung in der Zellhülle verändern. Die primären Strukturen, die dem Turgor entgegenwirken, sind die Peptidoglycan-Zellwand (PG) und die äußere Membran (OM)23. Um angemessene mechanische Eigenschaften aufrechtzuerhalten, müssen Bakterien daher die mechanische Integrität sowohl von PG als auch von OM aufrechterhalten, und dies scheint tatsächlich für OM der Fall zu sein23,24. Ob und wie die PG-Stärke homöostatisch kontrolliert wird, ist kaum bekannt.

Bei Vibrio cholerae ist das VxrAB-Zweikomponentensystem das wichtigste Zellwand-Stressreaktionssystem25,26,27. VxrAB wird durch die Exposition gegenüber zellwandwirksamen Antibiotika und die Überexpression zellwandlytischer Enzyme im Periplasma wie der Endopeptidase ShyA27,28 induziert. Bei der Induktion reguliert VxrAB seine eigene Expression sowie die Zellwandsynthesefunktionen, einschließlich der PG-Translokase MurJ, der wichtigsten PG-Synthasen (Penicillin-bindende Proteine, PBPs) und der PG-Vorläufersynthesegene (Abb. 1A)27. Folglich führt die Aktivierung von VxrAB zu einem erhöhten Zellwandgehalt und einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber osmotischem Schock27. Diese Mechanismen stehen im Einklang mit der Vorstellung, dass VxrAB zur Homöostase der Zellwand beiträgt, ähnlich wie WalKR im grampositiven Bakterium Bacillus subtilis29. In Übereinstimmung mit dieser Idee weist eine ∆vxrAB-Mutante während des normalen Wachstums eine erhöhte Zellbreite auf27, ein Befund, der zu erwarten wäre, wenn die Zellwandsteifigkeit beeinträchtigt wäre, der Turgordruck jedoch gleich bliebe. Wichtig ist, dass VxrAB auch nach der Exposition gegenüber zellwandwirksamen Antibiotika wie Beta-Lactamen überlebenswichtig ist27,28. Die Beta-Lactam-Exposition führt zu weitreichenden Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Zellhülle, einschließlich einer Veränderung von einer starren, stäbchenförmigen Zelle, die von einer Zellwand umgeben ist, zu einem membranösen Sphäroplasten30,31. Die Wiederherstellung aus dem Sphäroplastenzustand hängt hauptsächlich von VxrAB28 ab, vermutlich weil die Regeneration der Stäbchenform eine erhöhte Zellwandsynthese erfordert. Somit moduliert das VxrAB-System die mechanischen Eigenschaften der Zelle als Reaktion auf Ungleichgewichte im PG-Umsatz. Das Signal, das zur VxrAB-Induktion führt, ist jedoch noch unbekannt.

Die VxrAB-Signalisierung reagiert auf mechanische Belastung durch Extrusionsbelastung. (A) Bei Aktivierung phosphoryliert die Histidinkinase VxrA der inneren Membran den Reaktionsregulator VxrB, der die Genexpression von Regulons reguliert, zu denen murJ und vxrAB gehören. Transkriptionelle msfGFP-Fusionen für murJ und vxrAB wurden als Reporter für die VxrAB-Signalisierung verwendet. Die ShyA-Funktion fördert die VxrA-Signalisierung durch einen unbekannten Mechanismus. (B) Beim Extrusionsladen werden Bakterien unter Flüssigkeitsdruck in konische Kanäle gedrückt. (oben) Zellen verformen sich stärker und erfahren bei einem größeren Druckunterschied in konischen Kanälen eine größere mechanische Belastung. (unten) ΔcrvA PmurJ:msfGFP Vibrio cholerae, die GFP exprimieren, während sie in konischen Kanälen gefangen sind, werden gezeigt (dargestellt ist ein „Satz“ konischer Kanäle mit dem gleichen Differenzdruck). (C) Vibrio cholerae sind halbmondförmig. (D) Vibrio cholerae mit crvA-Deletion sind stäbchenförmig. (E) Einzelzellfluoreszenz von PmurJ:msfGFP-Zellen im Vergleich zur Druckdifferenz. Die durchgezogene Linie ist eine lineare Regression. (F) Einzelzellfluoreszenz von ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa) und (G) ΔcrvA ΔvxrB-Box PmurJ:msfGFP-Zellen (blau) vs. Druckdifferenz. Durchgezogene Linien sind lineare Regressionen. Die Steigung der ΔcrvA-PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa) ist größer als die Steigung der ΔcrvA-ΔvxrB-Box-PmurJ:msfGFP-Zellen (blau) (p < 0,001). (H) Die vxrA H301A-Mutante mit modifizierter Histidinkinase. (I) Einzelzellfluoreszenz von ΔcrvA PvxrAB:msfGFP-Zellen im Vergleich zur Druckdifferenz. Die durchgezogene Linie ist eine lineare Regression.

Hier untersuchen wir die VxrAB-kontrollierte Genexpression während der mechanischen Stimulation der Zellhülle von Vibrio cholerae. Wir haben mechanische Belastungen und Spannungen auf die Bakterienzellhülle ausgeübt, indem wir zwei unterschiedliche Belastungsmodalitäten genutzt haben: Extrusionsbelastung innerhalb eines Mikrofluidikgeräts, Kompression ganzer Zellen und hydrostatischen Druck. In jeder dieser Situationen stellen wir fest, dass Bakterien, die einer größeren mechanischen Belastung ausgesetzt sind, eine stärkere Aktivierung des VxrAB-Regulons aufweisen. Unsere Ergebnisse stützen die Idee, dass mechanischer Stress und Belastung eine Rolle bei der Regulierung der Synthese und Homöostase der Zellhülle spielen, und belegen die Existenz von Genregulationssystemen, die durch mechanischen Stress in der Zellhülle induziert werden können.

Um die Rolle mechanischer Belastung auf die VxrAB-Signalübertragung zu untersuchen, verwendeten wir ein maßgeschneidertes Mikrofluidikgerät, um kontrollierte, reproduzierbare mechanische Belastungen in einem Prozess auszuüben, den wir „Extrusionsbelastung“ nennen. Beim Extrusionsladen werden Bakterien durch Flüssigkeitsdruck in schmale, konische Kanäle mit Abmessungen im Submikrometerbereich gedrückt (Abb. 1B)18,32. Zellen bleiben in den sich verjüngenden Kanälen stecken und erfahren mechanische Kräfte, wenn sie durch die Kanalwände deformiert werden. Der Druckunterschied (∆P) über dem konischen Kanal reguliert die Größe der mechanischen Belastung, der eine eingeschlossene Zelle ausgesetzt ist. Zellen, die in den konischen Kanälen einem größeren Druckunterschied ausgesetzt sind, wandern weiter in die konischen Kanäle hinein und erfahren eine stärkere Verformung durch die Kanalwände und größere mechanische Belastungen. Analytische und Finite-Elemente-Modelle weisen darauf hin, dass die Extrusionsbelastung zu einer Zunahme der axialen Zugspannung (entlang der Länge einer stabförmigen Zelle), einer Verringerung der Ringzugspannung (umfänglich um die Zellhülle) und einer Zunahme der oktaedrischen Scherung (Formänderung) führt ) Stress in der Zellhülle18.

Wir verwendeten eine transkriptionelle PmurJ:msfGFP-Fusion als etablierten Reporter für die VxrAB-Signalübertragung (Abb. 1A). MurJ kodiert für die Lipid-II-Flipase für den Peptidoglycan-Vorläufer, und das Umdrehen des Peptidoglycan-Vorläufers in den periplasmatischen Raum ist entscheidend für den Zellwandaufbau33. Der Reaktionsregulator VxrB hat eine hohe Affinität für die direkte Bindung des murJ-Promotors28, und die murJ-Expression wird folglich stark von VxrAB27 kontrolliert, was dieses Konstrukt zu einem robusten Messwert für die VxrAB-Aktivierung macht. Wir haben zwei Stunden lang eine Extrusionsbelastung auf PmurJ:msfGFP-Zellen angewendet, um ausreichend Zeit für die Transkription und Proteinfaltung zu lassen, und dann die Fluoreszenz einzelner Zellen gemessen, um die msfGFP-Expression unter der Kontrolle des MurJ-Promotors zu quantifizieren. Die Fluoreszenz von PmurJ:msfGFP-Zellen nahm mit zunehmender Extrusionsbelastung zu (Abb. 1E), was die Annahme stützt, dass die VxrAB-Signalisierung mechanosensitiv ist (obwohl es möglich ist, dass die Fluoreszenz nach einem Differenzdruck von 3 kPa gesättigt ist).

Vibrio cholerae-Zellen weisen von Natur aus eine Halbmondform auf (Abb. 1C). Das Aufrichten einer halbmondförmigen Zelle im Inneren des Mikrofluidikgeräts während der Extrusionsbelastung führt zu zusätzlichen mechanischen Spannungen, einschließlich größerer Zugspannungen auf der konkaven Seite der Zelle und Druckspannungen auf der konvexen Seite. Um festzustellen, ob die mechanosensitive Fluoreszenzreaktion ausschließlich auf die durch die Zellausrichtung verursachten Belastungen zurückzuführen ist, haben wir durch Löschen von crvA (Abb. 1D)34 stäbchenförmige V. cholerae erzeugt und ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen einer Extrusionsbeladung unterzogen. CrvA ist ein periplasmatisches Polymerprotein, das für die Krümmung bei V. cholerae verantwortlich ist; Die Entfernung von crvA führt zu stäbchenförmigen Zellen34. Die Fluoreszenz von ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen nahm ebenfalls mit zunehmender Druckdifferenz zu (Abb. 1F, Magenta), was darauf hindeutet, dass eine Zellkrümmung für die mechanosensitive Fluoreszenzreaktion von PmurJ:msfGFP-Zellen während der Extrusionsbelastung nicht erforderlich ist. Der Unterschied in der Steigung der Fluoreszenz gegenüber dem Druckunterschied zwischen den sichelförmigen und den stäbchenförmigen Zellen kann durch die zusätzlichen Belastungen erklärt werden, denen sichelförmige Zellen durch das Aufrichten ausgesetzt sind. Alle nachfolgenden Experimente wurden mit stabförmigen ΔcrvA-Zellen durchgeführt. Das Autofluoreszenzsignal von ΔcrvA-Nicht-GFP-produzierenden Zellen war bei größeren Ausmaßen der Extrusionsbelastung weder erhöht (ergänzende Abbildung S1), noch stand die Reporterfluoreszenz in den ersten Minuten nach Beginn der Extrusionsbelastung in Zusammenhang mit der Größe der mechanischen Belastung (ergänzende Abbildung). S2).

Um zu bestätigen, dass die mechanosensitive Reaktion auf die VxrB-aktivierte Expression von PmurJ:msfGFP zurückzuführen war, verwendeten wir einen Mutanten mit einer teilweisen Deletion der VxrB-Bindungsstelle auf dem MurJ-Promotor (ΔcrvA PmurJΔvxrB box:msfGFP); Wir haben zuvor festgestellt, dass dieser Mutante tatsächlich keine VxrAB-Reaktionsfähigkeit aufweist 28 . Unter Extrusionsbelastung zeigte die Fluoreszenz solcher mutierten Zellen nur geringe, negative Korrelationen mit der Höhe des Drucks (Abb. 1G, blau). Zellen, denen vxrAB fehlt, zeigen keine mechanosensitive Reaktion (ergänzende Abbildung S3). In ähnlicher Weise führt eine Mutation im konservierten phosphorylierten Histidinrest in VxrA in seinem nativen chromosomalen Locus (Stamm H301A), die zu einer Phänokopie eines ∆vxrAB-Stammes führt (ergänzende Abbildung S4), zu einer schlechten Beziehung zwischen mechanischer Belastung und PmurJ-Signalisierung (Abb . 1H, p = 0,05). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die VxrB-Aktivierung durch die kanonische Histidinkinase-Funktion für die mechanosensitive Erhöhung der PmurJ:msfGFP-Expression erforderlich ist.

Zusätzlich zu seiner Rolle bei der MurJ-Induktion wird die VxrAB-Signalübertragung auch autoreguliert (Abb. 1A)28. Um zu bestätigen, dass die mechanosensitive Reaktion von VxrAB nicht auf den MurJ-Promotor beschränkt war, verwendeten wir auch einen PvxrAB:msfGFP-Reporterstamm als alternative Anzeige der VxrAB-Aktivierung. Die Zellfluoreszenz von PvxrAB:msfGFP-Zellen nahm bei größerem Druckunterschied zu (Abb. 1I), was bestätigt, dass mechanischer Stress in der Zellhülle die VxrAB-Signalisierung reguliert (beachten Sie, dass sich die Grundaktivität des VxrAB-Promotors von der des MurJ-Promotors unterscheidet, was zu unterschiedlichen Gesamtmengen führt der Zellfluoreszenz). Wir kommen zu dem Schluss, dass die VxrAB-Aktivierung empfindlich auf mechanische Belastung durch Extrusionsbelastung reagiert.

Um zu bestätigen, dass die mechanosensitive Reaktion der VxrAB-Signalübertragung nicht spezifisch für die Umgebung des Mikrofluidikgeräts oder die Formen mechanischer Spannungen ist, die durch Extrusionsbelastung erzeugt werden, haben wir die Reaktion der VxrAB-Signalübertragung auf andere Methoden der mechanischen Belastung untersucht.

Um eine Kompression auszuüben, wurden die Zellen zwischen Agarosegel und einem gewichteten Glasobjektträger gelegt (Abb. 2A). Bei größeren Größen der ausgeübten Kraft erfuhren die Zellen eine größere mechanische Belastung und verformten sich in der Bildebene zu einer größeren Zellbreite (ergänzende Abbildung S5). Die Kompression führt zu einem Anstieg der Zugspannung in Axial- und Ringrichtung und insgesamt zu einem Anstieg der oktaedrischen Scherspannung (Formänderungsspannung) innerhalb der Zellhülle. PmurJ:msfGFP-Zellen wurden zwei Stunden lang einer Kompressionsbelastung ausgesetzt (die gleiche Dauer, die Zellen unter Extrusionsbelastung erlebten), und dann wurde die Fluoreszenz einzelner Zellen gemessen, um die Expression von PmurJ:msfGFP zu quantifizieren. Obwohl es eine größere Variabilität der Zellfluoreszenz gab, stieg die Zellfluoreszenz im Durchschnitt um 30 % mit zunehmender Größe der ausgeübten Kompressionskraft (Abb. 2B, links), was darauf hindeutet, dass die VxrAB-Signalisierung empfindlich auf die Kompressionsbelastung reagiert. Im Gegensatz dazu war beim Löschen der vxrB-Box im Promotor (ΔvxrB-Box) die Beziehung zwischen Zellfluoreszenz und angewandter Kompressionskraft nicht erkennbar (Abb. 2B, rechts), was darauf hindeutet, dass der mechanosensitive Anstieg der Zellfluoreszenz für PmurJ:msfGFP-Zellen darunter liegt Für die Komprimierung war außerdem eine VxrB-Aktivierung erforderlich. Wir verwendeten erneut PvxrAB:msfGFP-Zellen als sekundären Reporter für die VxrAB-Signalisierung. Die Zellfluoreszenz von PvxrAB:msfGFP-Zellen nahm mit zunehmender ausgeübter Kompressionskraft zu (Abb. 2C), was die Idee weiter stützt, dass die mechanosensitive Reaktion auf Kompression durch VxrAB vermittelt wird. Wir stellen fest, dass die msfGFP-Fluoreszenz während der Kompressionsbelastung eine größere Varianz zwischen einzelnen Zellen aufweist als während der Extrusionsbelastung, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass diese Belastungsmodalität die Zellausrichtung relativ zur Belastung, die auf jede einzelne Person ausgeübte Belastung oder Zelle-Zelle nicht streng kontrolliert Dies alles kann den mechanischen Spannungszustand innerhalb der Zellhülle verändern.

Die VxrAB-Signalisierung reagiert auf mechanische Belastung durch Kompression und hydrostatischen Druck. (A) Während der Kompression werden die Zellen zwischen Agarosegel und einem gewichteten Glasobjektträger eingeklemmt. (B) Einzelzellfluoreszenz von ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa, n = 1130, 1160, 1304 in der Reihenfolge der Belastung), ΔcrvA ΔvxrB-Box PmurJ:msfGFP-Zellen (blau, n = 1461, 1189, 1304) und (C ) ΔcrvA PvxrAB:msfGFP-Zellen (grün, n = 1541, 1058, 1826) vs. angelegte Kompressionskraft. Durchgezogene Linien sind lineare Regressionen. Die Steigung der ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa) ist größer als die Steigung der ΔcrvA ΔvxrB-Box PmurJ:msfGFP-Zellen (blau) (p < 0,001). (D) Der hydrostatische Druck übt eine gleichmäßige Kraft auf alle Oberflächen der Zelle aus und komprimiert die Zellhülle. (E) Einzelzellfluoreszenz von ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa, n = 3845, 2261, 1393), ΔcrvA ΔvxrB Box PmurJ:msfGFP-Zellen (blau, n = 2085, 1194, 1554). Die Steigung der ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa) ist größer als die Steigung der ΔcrvA ΔvxrB-Box PmurJ:msfGFP-Zellen (blau) (p < 0,001). (F) ΔcrvA PvxrAB:msfGFP-Zellen (grün, n = 2332, 1971, 907) vs. hydrostatischer Druck. Durchgezogene Linien sind lineare Regressionen.

Um diese Ergebnisse zu ergänzen, haben wir die Rolle des hydrostatischen Drucks bei der VxrAB-Induktion untersucht. Hydrostatischer Druck übt eine Kraft senkrecht zu allen Oberflächen der Zellhülle aus (Abb. 2D–F). Extremer hydrostatischer Druck (> 50 MPa) führt zu Veränderungen der RNA-Synthese und DNA-Replikation und kann zum Zelltod führen35; Hier wenden wir einen milden hydrostatischen Druck von 0–100 kPa an (ein Bakterium erfährt 10 m unter Wasser einen hydrostatischen Druck von etwa 100 kPa), im Gegensatz dazu wird erwartet, dass eine Zelle, die das Magen-Darm-System des Wirts verlässt und in Brackwasser gelangt, einen Anstieg des Turgordrucks um 500 kPa erfährt . Hydrostatischer Druck erhöht die Druckspannungen senkrecht zur Zellhülle. Das Ausmaß der durch hydrostatischen Druck verursachten mechanischen Spannungen ist typischerweise viel geringer als die Ring- und Längsspannungen (parallel zur Zellhüllenoberfläche ausgerichtet), die durch Extrusionsbelastung oder Kompression erzeugt werden, können jedoch unter Bedingungen angewendeten hydrostatischen Drucks spürbar werden. Hydrostatischer Druck wurde auf in flüssigen Medien suspendierte Zellen in einer speziellen Kammer ausgeübt, die an eine Mikrofluidpumpe angeschlossen war. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen entnommen und sichtbar gemacht. Die durchschnittliche Zellfluoreszenz stieg mit zunehmender Größe der ausgeübten Kompressionskraft um 28 % (Abb. 2E, links), was die Annahme stützt, dass die VxrAB-Signalübertragung auch empfindlich auf hydrostatischen Druck reagiert. Nach dem Löschen der vxrB-Box im Promotor variierte die Zellfluoreszenz nicht mit dem angelegten hydrostatischen Druck (Abb. 2E, rechts), was bestätigt, dass der mechanosensitive Anstieg der Zellfluoreszenz für PmurJ:msfGFP-Zellen eine VxrB-Aktivierung erforderte. Wie in den Kompressionsexperimenten stimmte der PvxrAB:msfGFP-Reporterstamm mit den Beobachtungen mit PmurJ:msfGFP überein (Abb. 2F). Die Varianz bei der Fluoreszenz war größer als bei der Kompressionsbelastung, ein Ergebnis, das wir auf die Tatsache zurückführen, dass mechanische Spannungen in der Zellhülle auf radiale Kompression beschränkt sind und nicht so gut kontrolliert werden können (Zellkontakt mit den Wänden des Geräts und anderen Zellen). ist völlig unkontrolliert). Infolgedessen wurde die mechanosensitive Reaktion auf hydrostatischen Druck von einer Untergruppe von Zellen dominiert (oberer Teil der Zellpopulation in Abb. 2E, F). Wir kommen zu dem Schluss, dass die VxrAB-Signalübertragung auf verschiedene Methoden der mechanischen Belastung der Zellhülle reagiert.

Es ist bekannt, dass VxrAB über einen unbekannten Mechanismus auf Zellwandschäden reagiert, die durch zellwandwirksame Antibiotika verursacht werden, und auf die Aktivität der Endopeptidase ShyA (Abb. 1A)27. Die Endopeptidase ShyA spielt eine Schlüsselrolle bei der Zellwandhomöostase und Zellverlängerung durch kontrollierten Zellwandabbau in V. cholerae36. Die Entfernung von ShyA kann daher die Steifheit der Zellhülle modulieren, was sich auf VxrAB und die damit verbundene mechanosensorische Reaktion auswirken kann. Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die mechanosensitive Signalübertragung von VxrAB von Upstream-Signalen von ShyA abhängt, haben wir Mutanten, in denen shyA deletiert wurde, einer Extrusionsbelastung ausgesetzt und die resultierenden Änderungen in der Signalübertragung von VxrAB gemessen.

Tatsächlich zeigten ΔshyA PmurJ:msfGFP-Zellen eine deutlich gestörte Physiologie mit Blasen, Krümmungen und abnormaler Form, was auf die Möglichkeit einer Beeinträchtigung der mechanischen Eigenschaften der Zellhülle schließen lässt, die die Zellsteifigkeit verringern könnte (Abb. 3A). Zellen mit deletiertem shyA waren breiter als Zellen mit normaler shyA-Expression außerhalb des Mikrofluidikgeräts (Abb. 3B, oben vs. unten), eine Beobachtung, die zu erwarten war, wenn die Steifheit der Zellhülle verringert würde. Wir spekulieren, dass die Deletion von ShyA zu einer Verringerung der Steifheit der Zellhülle führen könnte, beispielsweise durch eine Überexpression anderer zellwandlytischer Enzyme. ShyA-defiziente Zellen wanderten während der Extrusionsbelastung nicht so weit in die verjüngten Kanäle wie Zellen mit normaler ShyA-Expression (Abb. 3C), was möglicherweise darauf hindeutet, dass Zellen mit defekter Endopeptidaseaktivität im Vergleich zu Zellen mit normaler ShyA-Expression eine unzureichende Zellverformung aufwiesen. Da sie jedoch anfänglich breiter sind, erfahren ΔshyA-PmurJ:msfGFP-Zellen tatsächlich eine größere mechanische Belastung/Verformung als die PmurJ:msfGFP-Zellen, obwohl sie sich nicht so weit im verjüngten Kanal bewegen. Beim Vergleich der Zellbreite innerhalb und außerhalb der sich verjüngenden Kanäle kam es bei ΔshyA PmurJ:msfGFP-Zellen tatsächlich zu einer stärkeren prozentualen Abnahme (durchschnittlich 40 % Abnahme, 0,91 ± 0,11 μm unverformt gegenüber 0,54 ± 0,09 μm beladen, Mittelwert ± SD) der Zellbreite im Vergleich zu PmurJ:msfGFP-Zellen (durchschnittlich 25 % Abnahme der Zellbreite, 0,67 ± 0,06 μm unverformt vs. 0,51 ± 0,03 μm geladen). Es ist zu erwarten, dass größere Verformungen innerhalb der sich verjüngenden Kanäle die Reaktion von Mechanismen verstärken, die auf mechanische Belastungen innerhalb der Zellhülle reagieren.

ShyA- und VxrAB-Mechanosensitivität. (A) Ein Bild der Zellmorphologie von ΔshyA ΔcrvA PmurJ:msfGFP, gewachsen in M9-Medium in einer Petrischale. Zellen weisen eine abnormale Morphologie auf. (B) Oben: ΔshyA ΔcrvA PmurJ:msfGFP Zellbreite in einer Petrischale. Unten: ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellbreite in einer Petrischale. (C) Die im konischen Kanal zurückgelegte Strecke für ΔshyA ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (schwarz) ist bei ähnlichen Druckgrößen geringer als in ΔcrvA PmurJ:msfGFP-Zellen (rosa). (D) Einzelzellfluoreszenz von ΔshyA ΔcrvA PvxrAB:msfGFP-Zellen im Vergleich zum Druckunterschied bei der Extrusionsbelastung (schwarz). (E) Die Einzelzellfluoreszenz von ΔshyA ΔcrvA ShyA + + PmurJ:msfGFP-Zellen gegenüber der Druckdifferenz zeigt eine Steigung (2216 ± 613, Schätzung ± SE), die näher an der in Abb. 1F (4690 ± 486) liegt. Die durchgezogene grüne Linie ist eine lineare Regression.

In Übereinstimmung mit dieser Möglichkeit war die Grundfluoreszenz von Zellen mit deletiertem shyA (ΔshyA PmurJ:msfGFP, durchschnittlich 8,84e + 04, Abb. 3D) unter Extrusionsbelastung größer als die von Zellen mit intaktem shyA (durchschnittlich 4,04e + 04). Abb. 1F). Die Reaktion korrelierte jedoch kaum mit der Größe der Extrusionsbelastung (eher ein leicht negativer als ein positiver Zusammenhang, Abb. 3D). Als ShyA in trans (ΔshyA ShyA + + PmurJ:msfGFP) wieder eingeführt wurde, wurde die mechanosensitive Reaktion teilweise wiederhergestellt: Die Zellfluoreszenz nahm mit zunehmender Druckdifferenz zu, mit einer Steigung, die näher an der im ΔcrvA PmurJ:msfGFP beobachteten Steigung lag (Abb. 3E im Vergleich zu rosa Linie in Abb. 1F). Da Zellen in konischen Kanälen für beide Gruppen den gleichen Druckunterschied erfahren, ist die schlechte Korrelation zwischen Fluoreszenz und Druckunterschied in den ΔshyA PmurJ:msfGFP-Zellen nicht auf Unterschiede in der angewandten mechanischen Kraft zurückzuführen. Stattdessen interpretieren wir diesen Befund als eine sehr hohe, möglicherweise sättigende Induktion des VxrAB-Signals unter den größeren Ausmaßen der Verformung, die ΔshyA-Zellen erfahren. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass das Fehlen von ShyA zu Veränderungen in der PG-Struktur führt, die die VxrAB-vermittelte Mechanosensierung nicht mehr begünstigen. Obwohl die Mechanotransduktionsmechanismen, die VxrAB mechanosensitiv machen, weiterhin unklar sind, zeigen diese Ergebnisse, wie die Steifheit der Zellhülle die Reaktion der VxrAB-Signalübertragung auf mechanische Belastung regulieren kann.

Wir haben gezeigt, dass das Zweikomponenten-Signalsystem VxrAB durch mechanische Belastung in der Zellhülle aktiviert wird, die durch bestimmte mechanische Belastungsmodalitäten verursacht wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanosensitive Mechanismen innerhalb der Zellhülle die Genexpression regulieren können, die an der Zellwandumgestaltung beteiligt ist.

Unsere Erkenntnisse zur Mechanosensitivität von VxrAB stimmen mit der Vorstellung überein, dass mechanischer Stress und Belastung zur Zellwandhomöostase beitragen können. Die Fähigkeit mechanischer Beanspruchung und Beanspruchung, zur Umgestaltung einer tragenden Komponente wie der Zellwand beizutragen, ist ein wirksames Mittel zur Aufrechterhaltung der Funktion der Zellhülle. Während uns keine anderen Studien bekannt sind, die die Auswirkungen von mechanischem Stress auf die Zellwanderhaltung bei anderen Bakterien direkt untersuchen, gibt es andere Zweikomponentensysteme, die den Zellwandumbau regulieren. Das Zweikomponentensystem WalKR in Bacillus subtilis reagiert auf den Abbau von Zellwandbestandteilen, um den Umbau der Zellwand zu regulieren29. Darüber hinaus deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass die äußere Membran auch mechanische Belastungen tragen kann23, was die Möglichkeit eröffnet, dass die Synthese und der Transport von Komponenten der äußeren Membran empfindlich auf mechanische Belastungen reagieren.

Eine Einschränkung dieser Studie ist die Varianz der Fluoreszenzreaktion zwischen Zellen bei jeder angewendeten Belastungsgröße. Die Größe der Varianz folgt dem gleichen Muster wie der Grad der Kontrolle der mechanischen Belastung jeder Zelle (größte Kontrolle im Mikrofluidiksystem, weniger bei der Kompressionsbelastung, noch weniger beim hydrostatischen Druck), was darauf hindeutet, dass die Variation der mechanischen Belastungen, denen einzelne Zellen ausgesetzt sind, unterschiedlich ist die Hauptursache. Selbst mit dem am besten kontrollierten Belastungssystem ist es wahrscheinlich, dass von Zelle zu Zelle Unterschiede bestehen bleiben, die durch die Zellphysiologie oder natürliche Unterschiede in der Steifheit der Zellhülle innerhalb der Population verursacht werden können. Weitere Untersuchungen wären erforderlich, um die Ursachen dieser Varianz genauer zu verstehen. Trotz dieser Einschränkung ermöglicht die große Anzahl der untersuchten Zellen die Erkennung aussagekräftiger Trends im Zusammenhang mit der angewendeten mechanischen Belastung und der VxrAB-Signalisierung.

Die mechanosensitive Natur von VxrAB lässt auf mögliche Anwendungen im Bereich der synthetischen Biologie schließen. Genregulationsmechanismen, die auf die äußere Umgebung reagieren, sind wichtige Werkzeuge auf dem Gebiet der synthetischen Biologie. Systeme, die auf Zielchemikalien, Licht, Temperatur und pH-Wert reagieren, wurden zur Steuerung synthetischer Genschaltkreise verwendet37. Unsere Arbeit zeigt, dass Zweikomponentensysteme auf mechanische Belastungen in der Zellhülle reagieren können und einen zusätzlichen mechanischen Mechanismus zur Stimulierung von Genschaltkreisen für Anwendungen in der synthetischen Biologie bereitstellen.

Die hier verwendeten Methoden zur Herstellung mikrofluidischer Geräte ähneln den in unseren zuvor veröffentlichten Arbeiten18,32 beschriebenen Methoden, mit der Ausnahme, dass die Ätztiefe reduziert wurde, um den kleineren Zellabmessungen von Vibrio cholerae im Vergleich zu E. coli Rechnung zu tragen, die in früheren Arbeiten untersucht wurden. Quarzglaswafer (100 mm Durchmesser und 500 µm Dicke, WF3937X02031190, Mark Optics, Santa Ana, CA, USA) wurden mithilfe von Deep-UV-Photolithographie in der Reinraumanlage der Cornell NanoScale Facility Science and Technology Facility (Ithaca, NY, USA) strukturiert. Saubere Quarzglaswafer wurden zunächst mit dem AJA Sputter Deposition Tool (AJA International, Scituate MA, USA) mit ~ 55 nm Chrom beschichtet. Anschließend wurde mit dem Gamma Automatic Coat-Develop Tool (Suss MicroTec Gamma Cluster Tool, Garching Deutschland) eine ca. 60 nm dicke Schicht Antireflexbeschichtung (ARC, DUV 42P, Brewer Science, Rolla, MO, USA) und ca. 510 nm aufgetragen nm-Schicht aus Fotolack (UV210, MicroChem, Westborough, MA, USA). Der Fotolack wurde mit dem ASML Deep UV Stepper (Veldhoven Niederlande) unserem maßgeschneiderten Mikrofluidik-Gerätemuster ausgesetzt und anschließend wurde der Fotolack sofort mit dem Gamma Automatic Coat-Develop Tool entwickelt. Das Muster wurde durch Plasmaätzen im Oxford 82 Tool (Oxford, Abingdon, UK) vom Fotolack auf die Antireflexbeschichtung übertragen und dann durch Plasmaätzen mit dem Plasma-Therm 770 ICP-Tool (Plasma-Therm) auf die Chromschicht übertragen St. Petersburg FL, USA). Die verbleibende Antireflexbeschichtung wurde mit einer Plasma-Sauerstoff-Reinigung im Oxford 82 Tool entfernt. Schließlich wurde das Muster durch Plasmaätzen mit dem Oxford 100 Tool (Oxford, Abingdon, UK) auf das Quarzglas übertragen. Das restliche Chrom wurde mit einem nasschemischen Bad entfernt. Mit einem Versalaser (VLS3.50, Universal Laser Systems, Scottsdale, AZ, USA) wurden Durchgangslöcher an den Ein- und Auslässen des Mikrofluidikgeräts lasergeätzt.

Die Abmessungen der Wafermerkmale wurden mit einem Profilometer, einem Rasterkraftmikroskop und einem Rasterelektronenmikroskop charakterisiert. Die angestrebte Ätztiefe für die Kanäle war mindestens zwei Standardabweichungen größer als die Zellbreite (> 0,80 µm), sodass die Zellen ungehindert durch alle Zuführkanäle fließen konnten und nur in der engen Verengung der konischen Kanäle stecken blieben. Die Ätztiefe des Feeder-Kanals wurde mit einem Profilometer (P-7, KLA Inc, Milpitas CA, USA) charakterisiert. Die Profilometerspitze war zu breit, um die sich verjüngenden Kanäle zu messen, daher wurde eine Spitze mit einem Rasterkraftmikroskop mit hohem Seitenverhältnis verwendet, um die Ätztiefe der sich verjüngenden Kanäle zu messen (Veeco Icon Bruker, Billerica MA, USA). Die Kanalätztiefe betrug 0,88 ± 0,03 µm. Ein Rasterelektronenmikroskop (Zeiss Ultra 55 SEM-Mikroskop, Oberkocken, Deutschland) wurde verwendet, um die Einlassbreite (1,48 ± 0,07 µm) und Auslassbreite (0,35 ± 0,02 µm) des konischen Kanals zu messen. Der konische Kanaleinlass ist breit genug, dass Zellen eindringen können, und der Auslass ist schmal genug, um ein Herausfließen der Zellen zu verhindern.

Die gemusterten Wafer wurden mit Quarzglas-Abdeckwafern (WF3937X0073119B Mark Optics, Santa Ana, CA, USA) mit einem Durchmesser von 100 mm und einer Dicke von 170 µm verbunden. Die Dicke des Deckwafers wurde so gewählt, dass sie der Dicke von Standard-Deckgläsern entspricht. Sowohl die strukturierten Wafer als auch die Abdeckwafer wurden vor dem Bonden MOS/RCA-gereinigt. Die Wafer wurden vorsichtig von Hand gebondet und anschließend 5 Stunden lang einem Stickstoffglühen bei 1100 °C unterzogen. Die Wafer durften vor der Verwendung mindestens eine Woche ruhen, damit die Bindung reifen konnte.

Das Design mikrofluidischer Geräte wurde bereits in unseren veröffentlichten Arbeiten beschrieben18,32. Der Flüssigkeitsdruck drückt Bakterienzellen in enge, sich verjüngende Kanäle, ein Vorgang, den wir als Extrusionsbeladung bezeichnen (ergänzende Abbildung S6). Während die Zelle durch die Kanalwände verengt wird, erfährt sie eine Verformung sowie mechanische Beanspruchung in der Zellhülle. Der Flüssigkeitsdruck ist am breiten Einlass des Kanals höher und am schmalen Auslass des Kanals niedriger, wodurch die Zellen zum Auslass gedrückt werden. Wir bezeichnen den Druckunterschied zwischen dem breiten Einlass und dem schmalen Auslass des konischen Kanals als Druckdifferenz (ΔP). Zellen in Verjüngungen mit einem größeren Druckunterschied erfahren eine größere mechanische Belastung, wandern weiter in den verjüngten Kanal hinein und verformen sich stärker als Zellen in Verjüngungen mit einem geringeren Druckunterschied. Die Distanz, die die Zelle in den konischen Kanal zurücklegt, hängt von der Größe der Druckdifferenz, der anfänglichen Zellbreite, der Zellsteifigkeit und der Zellbreite vor dem Eintritt in den konischen Kanal ab.

Bei jedem Experiment werden Hunderte von Zellen unter unterschiedlichen Belastungsgrößen beobachtet. Zwölf Sätze von fünf konischen Kanälen werden parallel geschaltet und durch einen Bypass-Kanal verbunden (ergänzende Abbildung S6). Der Druck ist am Einlass des Bypass-Kanals am höchsten und am Auslass des Bypass-Kanals am niedrigsten, da der Druckverlust durch den hydraulischen Widerstand bedingt ist. Daher erfahren die konischen Kanäle in der Nähe des Bypass-Einlasses und -Auslasses die größte Druckdifferenz (ΔP) (ergänzende Abbildung S6). Zehn Bypasskanäle werden parallel geschaltet und über Zuführkanäle mit einem einzigen Eingangsanschluss für das Mikrofluidikgerät verbunden (ergänzende Abbildung S6). Während die Zellen in den sich verjüngenden Kanälen eingeschlossen bleiben, bleiben sie stundenlang am Leben und es kann beobachtet werden, wie sie sich verlängern und teilen.

Flüssigkeitsdruck wurde verwendet, um die Zellen in das Mikrofluidikgerät zu laden. Der Druck wurde mit einer PneuWave-Pumpe (CorSolutions, Ithaca NY, USA) erzeugt. PEEK-Schläuche (Idex 360 µm OD × 150 µm ID, Lake Forest IL, USA) wurden an die PneuWave-Pumpe angeschlossen. Isopropanolalkohol wurde zur Sterilisation 5 Minuten lang durch den PEEK-Schlauch gespült, dann wurde M9-Minimalmedium 5 Minuten lang durch den Schlauch gespült, um den Isopropanolalkohol zu entfernen und den Schlauch für Zellen vorzubereiten. Ein magnetischer Verbindungshebelarm (Fluidic Indexing Probe, CorSolutions, Ithaca NY, USA) und eine Dichtung (N-123-03 IDEX, Lake Forest IL, USA) wurden verwendet, um eine Kompressionsdichtung zu bilden, die den PEEK-Schlauch mit dem Mikrofluidikgerät verbindet. M9-Minimalmedium wurde durch das Mikrofluidikgerät geleitet, um alle Kanäle vorzubefeuchten und etwaige Blasen herauszudrücken.

Der Schlauch und das Verbindungsstück wurden vom Mikrofluidikgerät getrennt und die Zellkultur wurde 5 Minuten lang bei einem Druck von 60 kPa durch den Schlauch gespült. Der Schlauch wurde dann wieder am Mikrofluidikgerät befestigt und die Zellen wurden in das Gerät geleitet. Der angelegte Druck wurde für den Rest des Experiments bei 60 kPa gehalten. Die Bildgebung begann zwei Stunden, nachdem alle Druckstufen im Mikrofluidikgerät mit Zellen beladen waren. Der Zwei-Stunden-Zeitpunkt wurde aus Vorversuchen ermittelt; Das Fluoreszenzsignal stieg vom Beginn des Experiments bis 2 Stunden an und blieb dann von 2 bis 6 Stunden konstant.

Der Fluiddruck an den konischen Kanälen innerhalb des Mikrofluidikgeräts konnte nicht direkt gemessen werden, daher wurde er anhand des Drucks am Eingang des Geräts (gemessen mit der PneuWave-Pumpe) und eines hydraulischen Schaltkreismodells mit dem Hagen-Poiseuille-Gesetz (Gl . 1). ΔP ist der Druckunterschied zwischen dem stromaufwärtigen Ende und dem stromabwärtigen Ende eines Kanals, Q ist die Durchflussrate und Rh ist der hydraulische Widerstand des Kanals.

Der hydraulische Widerstand jedes linearen Kanals im Mikrofluidikgerät wurde einzeln bestimmt, indem entweder der Poiseuille-Fluss (Gleichungen 2 und 3) oder der ebene Poiseuille-Fluss (Gleichung 4) verwendet wurde, wobei μ die Flüssigkeitsviskosität ist (angenommen als Viskosität von Wasser = 8,9 e). −4 Pa s), L ist die Länge des Kanals, A ist die Fläche des Kanalquerschnitts, r ist der hydraulische Radius, P ist der Umfang des Kanalquerschnitts und H ist die Höhe des Kanals . Die Poiseuille-Strömung (Gleichung 2 und 3) wurde für Kanäle verwendet, bei denen das Verhältnis der Kanalquerschnittsbreite zur Kanalquerschnittshöhe weniger als 20 betrug, und die ebene Poiseuille-Strömung (Gleichung 4) wurde für Kanäle verwendet, bei denen das Verhältnis war größer als 20.

Der hydraulische Widerstand des gesamten Mikrofluidikgeräts wurde durch Kombination des hydraulischen Widerstands aller einzelnen linearen Kanäle bestimmt. Parallele Kanäle wurden mit Gl. kombiniert. (5) wobei RTotal der kombinierte hydraulische Widerstand der Kanäle 1 bis n ist.

Segmente in Reihe wurden mit Gl. kombiniert. (6) wobei RTotal der kombinierte hydraulische Widerstand der Kanäle 1 bis n ist.

Aufgrund der komplexen Geometrie der Geräte wurden diese hydraulischen Schaltkreisberechnungen mithilfe eines benutzerdefinierten Skripts in MATLAB (Version 2019a, Mathworks, Natick, MA, USA) durchgeführt.

Wenn eine Zelle einen sich verjüngenden Kanal einnimmt, blockiert die Zelle teilweise den Flüssigkeitsfluss und führt dadurch zu einer Erhöhung des hydraulischen Widerstands dieses Kanals. Da das Flüssigkeitsströmungsprofil um die Zelle herum unregelmäßig ist (der konische Kanal hat einen trapezförmigen Querschnitt und eine Zelle einen kreisförmigen Querschnitt), gilt Gl. (2) und (3) waren nicht angemessen. Um den hydraulischen Widerstand eines von einer Zelle besetzten konischen Kanals zu bestimmen, haben wir mit COMSOL Multiphysics (Version 4.3, Stockholm, Schweden) ein Modell erstellt. Der hydraulische Widerstand eines konischen Kanals, der von einer Zelle besetzt ist, ist um eine Größenordnung größer als der eines konischen Kanals ohne Zelle. In Übereinstimmung mit experimentellen Beobachtungen wurde angenommen, dass alle konischen Kanäle mit einer Zelle besetzt waren.

Die Zellabmessungen und die Zellfluoreszenz wurden mithilfe eines benutzerdefinierten Skripts in MATLAB (v. 2019a, Mathworks, Natick, MA, USA) bestimmt. Die Zellabmessungen jeder Zelle in den Mikrofluidikgeräten wurden aus dem optischen Transmissionsbild bestimmt. Die optischen Eigenschaften der Kanalwände schränkten den Nutzen automatischer Zellerkennungssoftware ein und machten einen halbautomatischen Ansatz erforderlich. Regionen mit Zellen wurden manuell identifiziert (ergänzende Abbildung S7); Es wurden horizontale und vertikale Linienprofile erstellt. Der Mittelpunkt zwischen den Spitzen und Tälern der Linienprofile wurde zur Bestimmung der Zellgrenzen verwendet (ergänzende Abbildung S7). Die Distanz, die die Zelle in den sich verjüngenden Kanal zurücklegte, wurde als Abstand zwischen dem Zellschwerpunkt und dem Einlass des sich verjüngenden Kanals gemessen.

Die anhand des optischen Transmissionsbilds identifizierte Zellgrenze wurde auf dem Fluoreszenzbild an derselben Stelle abgebildet. Zur Berechnung der Zellfluoreszenz wurden die Pixelintensitäten aller Pixel in der Zellgrenze summiert. Alle Messungen wurden um die Hintergrundfluoreszenz korrigiert, indem die mittlere Fluoreszenzintensität des gesamten Fluoreszenzbildes multipliziert mit der Anzahl der Pixel innerhalb der Zellgrenze subtrahiert wurde (ergänzende Abbildung S8). Die Gesamtfluoreszenz wurde entsprechend den experimentellen Bildgebungsparametern weiter normalisiert. Wie in der Ergänzungstabelle S1 zusammengefasst, wurden die Bildgebungsparameter während der Experimente aufgrund des intrinsischen Proteinexpressionsniveaus und des Probenhintergrunds für verschiedene Stämme und mechanische Belastungsmethoden variiert, um die EMCCD-Kamera nicht zu überlasten. Hier wurden alle Fluoreszenzmessungen zum Vergleich auf die Bildgebungsparameter von ΔcrvA PmurJ:msfGFP im Mikrofluidikgerät normiert (Integrationszeit tnorm = 20 ms, EMnorm = 200 und Powernorm = 3,6 kW/cm2). Die normalisierte Gesamtfluoreszenz (FLnorm) wurde unter Verwendung von Gl. berechnet. (7):

Beispielsweise wurde die hintergrundkorrigierte Gesamtfluoreszenz (FLvxrAB), die aus Schnappschüssen von ΔcrvA PvxrAB:msfGFP in einem Mikrofluidikgerät berechnet wurde (Farbton = 4 ms, EM = 100 und Leistung = 3,6 kW/cm2), wie folgt normalisiert:

Die Zellgrenze wurde mithilfe einer speziell geschriebenen MATLAB-Software namens iQPALM38 (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12642617.v1) identifiziert und im entsprechenden Fluoreszenzbild wurde die Gesamtfluoreszenz der Zelle als Summe quantifiziert der Intensität aller Pixel innerhalb der Zellmaske, wie in der Ergänzungstabelle S3 dargestellt. Der durchschnittliche fluoreszierende Hintergrund wurde als Durchschnitt von 20 zufälligen Pixeln außerhalb der Zellen berechnet.

Die durchschnittliche Fluoreszenz des Hintergrunds wurde dann von jedem Pixel im Bild abgezogen, um ein korrigiertes Bild zu erstellen. Die Gesamtfluoreszenz jeder Zelle wurde dann ermittelt, indem die Fluoreszenz jedes Pixels in der Zellmaske des korrigierten Bildes addiert wurde. Dieser Wert wurde basierend auf den Bildgebungsparametern (Ergänzungstabelle S1) weiter normalisiert, um der GFP-Bildgebung im Mikrofluidikgerät wie oben beschrieben zu entsprechen.

Die Zellen wurden über Nacht (18 Stunden) in LB (Sigma-Aldrich) mit geeigneten Antibiotika bei 37 °C unter Schütteln mit 250 U/min gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde im Verhältnis 1:100 in M9-Minimalmedium verdünnt, ergänzt mit 8 % v/v 50X MEM-Aminosäuren (GIBCO) und 4 % 100X Vitaminen (GIBCO), was in späteren Methoden als ergänztes M9 bezeichnet wird. Die Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet, bis OD600 ~ 0,4 die exponentielle Phase erreichten, dann zentrifugiert und in frisch ergänztem M9-Minimalmedium resuspendiert.

Für Experimente mit der Induktion von Isopropyl-ß-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) wurden der Zellkultur nach der 4-stündigen Verdünnung 100 µM IPTG (Sigma-Aldrich) zugesetzt und eine weitere Stunde bei 37 °C inkubiert, bevor die Zellen in die Zellkultur geladen wurden mikrofluidisches Gerät und wird während der gesamten Dauer des Experiments beibehalten.

Für die Kompressionsexperimente wurden die Zellübernachtkultur und die Verdünnung wie in SI Abschn. 2 beschrieben vorbereitet. 0. Zwei Milliliter der 4-Stunden-Verdünnung wurden abzentrifugiert und in 30 μl des ergänzten M9 resuspendiert. Die Zellen wurden zur Gewichtsaufbringung und Bildgebung immobilisiert, nachdem sie zwischen einem 3 %igen (Gew./Vol.) Agarosegel und einem Deckglas platziert wurden. Um den Aufbau der Kompressionsprobe durchzuführen, wurde Agarose (Sigma-Aldrich) in dem ergänzten M9 durch Erhitzen in einer Mikrowelle gelöst und 50 μl der geschmolzenen Agarose auf einen Glasobjektträger getropft, gefolgt von der Zugabe eines weiteren Glasobjektträgers, der anschließend entfernt wurde das Agarosegel verfestigte sich bei Raumtemperatur. Zwei Mikroliter der konzentrierten Zellprobe wurden auf die Oberfläche des Agarosegels gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt. Das ergänzte M9 wurde seitlich hinzugefügt, um ein Austrocknen des Systems zu verhindern, und vor der Bildgebung wurden 2 Stunden lang Edelstahlgewichte auf das Deckglas aufgebracht. Wir beobachteten, dass Zellen bei größerer Krafteinwirkung eine stärkere Verformung erfuhren, was durch eine größere Zellbreite belegt wurde (ergänzende Abbildung S5).

Mit einer PneuWave-Pumpe (CorSolutions, Ithaca NY, USA) wurde hydrostatischer Druck auf eine Zellkultur in großen Mengen ausgeübt. Um jeglichen Durchfluss zu verhindern, wurde ein speziell angefertigter Stopfen verwendet. Zwei ergänzte M9-Zellverdünnungen wurden hergestellt und 4 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert, wie in den ergänzenden Materialien beschrieben. In der Zwischenzeit wurden 0,03 % Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) in die Petrischale gegeben und 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um das Deckglas zu funktionalisieren. Die überschüssige Poly-L-Lysin-Lösung wurde nach 4 Stunden mit nanoreinem sterilem Wasser ausgewaschen. Eine der ergänzten M9-Verdünnungen wurde dann zwei Stunden lang unter hydrostatischem Druck gehalten, während die andere unter Atmosphärendruck gehalten wurde. Nach Druckentlastung wurden sofort 2 ml Zellen abzentrifugiert, in 200 μl ergänztem M9 resuspendiert und 50 μl in eines der Fächer einer Petrischale (CELLview, Glasboden, vier Fächer) gegeben. Das gleiche Verfahren wurde für eine Kontrollzellverdünnung angewendet, bei der kein Druck angewendet wurde. Nachdem die Zellprobe 3–5 Minuten lang auf der Petrischale inkubiert worden war, wurde die Schale durch mindestens dreimaliges Pipettieren mit ergänztem M9 gewaschen, um nicht anhaftende schwimmende Zellen zu entfernen, bevor 200 μl ergänztes M9 in jedes Fach gegeben wurden.

Um die Veränderung des zellulären GFP-Expressionsniveaus unter verschiedenen mechanischen Reizen zu überwachen, verwendeten wir ein inverses Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 71), um die Zellen mit einem 488-nm-Laser (Coherent INC, Sapphire 488-200 CW CDRH) im Weitfeld-Epi zu beleuchten Modus. Für den Nachweis der grünen Fluoreszenz von msfGFP wurde ein Bandpassfilter (Semrock, FF01-525/50) verwendet. Aufgrund des Unterschieds im intrinsischen Genexpressionsniveau variierten die Beleuchtungsimpulsdauer, die EM-Verstärkung und die lokale Laserleistungsdichte für die GFP-Tags auf dem VxrA-Promotor und dem MurJ-Promotor, um die EMCDD-Kamera (Andor Technology, DU-897E) nicht zu sättigen -CSO-#BV), wie in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Ein Pi-Shaper-Strahlformer mit flacher Oberseite (Edmund Optics, Nr. 12-644) wurde verwendet, um die Laserstrahlgröße in den Kompressionsexperimenten für einen höheren Durchsatz zu erweitern.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme und Oligonukleotide sind in den Ergänzungstabellen S2 und S3 zusammengefasst. Alle in dieser Studie verwendeten V. cholerae-Stämme waren Derivate des V. cholerae WT El Tor-Stamms N16961, die auf Luria-Bertani (LB)-Medium mit geeigneten Antibiotika gezüchtet wurden: Streptomycin (RPI, Kat.-Nr. S62000), 200 μg ml–1; Ampicillin (RPI, Kat.-Nr. A40040), 100 μg ml−1; Carbenicillin (RPI, Kat.-Nr. C46000), 50 μg ml−1; Kanamycin (RPI, Kat.-Nr. K22000), 20 μg ml−1. Für die native oder IPTG-Promotor-Induktion 100 μg ml−1 Benzylpenicillin-Kaliumsalz (PenG-Fisher BioReagents, Kat.-Nr. BP914-100) oder 100 ~ 500 μM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG-GOLDBIO, Kat.-Nr. 12481C50) werden jeweils ergänzt. Sofern nicht anders angegeben, wurden LB-Flüssigmedien aus einer Übernachtkultur beimpft und bei 37 °C unter Schütteln mit 200 U/min bis zum Erreichen der mittleren Exponentialphase (OD600 ~ 0,4) inkubiert.

Escherichia coli DH5α λpir und SM10 λpir wurden für alle Klonierungsverfahren durch isotherme Assemblierung {Gibson Assembly39} oder konjugalen Gentransfer in Vibrio-Stämme verwendet. Knockout-Stämme wurden durch homologe Rekombination unter Verwendung des Suizidvektors pCVD44240 und amplifizierter PCR-Produkte aus Primerkombinationen und Genblock in der Ergänzungstabelle S3 erzeugt. Für Promotor- und msfGFP-Fusionsstämme wurden amplifizierte Promotor-DNAs von murJ oder vxrAB in pJL1 kloniert, einen Suizidvektor für die chromosomale Integration in den lacZ-Locus. Für ShyA-Überexpressionsstämme wurde ShyA unter Verwendung von Primerpaaren für ShyA (TD-JHS548/549) in pHL100mob kloniert und das endgültige Konstrukt wurde in eine Vielzahl von Vibrio-Stämmen als episomales Kopieplasmid mit Kanamycin-Resistenzgen zur Plasmiderhaltung eingeführt. Die Konstruktion des Stammes vxrA::vxrAH301A ist in Lit. 27 beschrieben. Reporter wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von pJL1 in diesen Stamm eingeführt.

Obwohl Komplemente von Mutanten, einschließlich PmurJ:msfGFP, PmurJΔvxrB box:msfGFP, vxrA H301A und PvxrAB:msfGFP, ebenfalls nützlich sein könnten, bieten die drei Mutanten ausreichend genetische Störung, um die Beziehung zwischen mechanischem Stress und vxrAB-Signalisierung zu testen und gleichzeitig die arbeitsintensive Herstellung auszugleichen von mikrofluidischen Systemen zur Prüfung unter Extrusionsbelastung.

Gewöhnliche lineare Regressionsmodelle der kleinsten Quadrate wurden verwendet, um Trends in den Daten zu bestimmen. Beim Vergleich der Trends zwischen einzelnen Gruppen wurde eine multivariate lineare Regression mit der Tukey-Methode zur Korrektur mehrerer Vergleiche verwendet. Statistische Analysen wurden mit einem Signifikanzniveau von α = (0,05) durchgeführt. Die Daten wurden mit RStudio analysiert.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinem Zusatzmaterial verfügbar.

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Wir danken NSF 2055214, 2135586 (CJH) und NSF GRFP DGE-1650441 (CEH) für Forschungsunterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise in der Cornell NanoScale Facility durchgeführt, einem Mitglied der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), die von der National Science Foundation (Grant NNCI-2025233) unterstützt wird. Die Forschung zu VxrAB im Dörr-Labor wird vom National Institutes of Health (NIH/NIAID) Grant R01AI143704 unterstützt. MRK wird von NSF GRFP #DGE-1650441 unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Christine E. Harper und Wenyao Zhang.

Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, Ithaca, NY, 14853, USA

Christine E. Harper, Junsung Lee, Ellen van Wijngaarden und Emily Chou

Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, Ithaca, NY, 14853, USA

Christine E. Harper

Abteilung für Chemie und chemische Biologie, Cornell University, Ithaca, NY, 14853, USA

Wenyao Zhang, Zhaohong Wang und Peng Chen

Weill Institute for Cell and Molecular Biology, Cornell University, Ithaca, NY, 14853, USA

Jung-Ho Shin, Megan R. Keller & Tobias Dörr

Abteilung für Mikrobiologie, Cornell University, Ithaca, NY, 14853, USA

Jung-Ho Shin & Tobias Dörr

Cornell Institute of Host-Microbe Interactions and Disease, Cornell University, Ithaca, NY, 14853, USA

Tobias Dörr

Abteilung für Bioingenieurwesen und Therapiewissenschaften und orthopädische Chirurgie, University of California, San Francisco, CA, 94143, USA

Christopher J. Hernandez

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, 94158, USA

Christopher J. Hernandez

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CEH: schrieb das Manuskript, führte Experimente mit mechanischen Reizen (Extrusionsbelastung, hydrostatischer Druck und Kompression) und Bildgebung durch, analysierte und kuratierte Daten, führte statistische Analysen durch, stellte mikrofluidische Geräte her, schrieb ein Skript für die Bildverarbeitung, führte eine Bildverarbeitung durch; WZ: schrieb das Manuskript, führte Experimente mit mechanischen Reizen (Extrusionsbelastung, hydrostatischer Druck und Kompression) und Bildgebung durch, analysierte Daten, führte Bildverarbeitung durch; J.-HS und MRK: konstruierte Stämme; EW: Komprimierungsexperimente durchgeführt, Bildverarbeitung durchgeführt; EC: durchgeführte Bildverarbeitung; JL führte hydrostatische Druckexperimente durch; ZW: trug zur Probenvorbereitung und Bildgebung bei; TD entwarf und leitete die Forschung, redigierte das Manuskript; PC konzipierte und leitete Recherchen, redigierte Manuskripte; CJH entwarf und leitete die Forschung und redigierte das Manuskript.

Korrespondenz mit Tobias Dörr, Peng Chen oder Christopher J. Hernandez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Harper, CE, Zhang, W., Lee, J. et al. Mechanische Reize aktivieren die Genexpression über einen Signalweg zur Stresserkennung in der Zellhülle. Sci Rep 13, 13979 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40897-w

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Eingegangen: 14. Juni 2023

Angenommen: 17. August 2023

Veröffentlicht: 26. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40897-w

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