Schnell und fleckig

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Ein Plaque-Assay – die Goldstandardmethode zur Messung der Konzentration replikationskompetenter lytischer Virionen – erfordert eine Färbung und in der Regel mehr als 48 Stunden Laufzeit. Hier zeigen wir, dass linsenlose holographische Bildgebung und Deep Learning kombiniert werden können, um den Assay zu beschleunigen und zu automatisieren. Das kompakte Bildgebungsgerät erfasst Phaseninformationen markierungsfrei mit einer Rate von etwa 0,32 Gigapixeln pro Stunde und Well, deckt eine Fläche von etwa 30 × 30 mm2 und einen 10-fach größeren dynamischen Bereich der Viruskonzentration als Standardtests ab und quantifiziert die Infizierten Fläche und die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten. Für das vesikuläre Stomatitis-Virus erkannte der automatisierte Plaque-Assay die ersten Zelllyseereignisse, die durch die Virusreplikation verursacht wurden, bereits 5 Stunden nach der Inkubation, und in weniger als 20 Stunden wurden Plaque-bildende Einheiten mit Raten von mehr als 90 % bei 100 % nachgewiesen. Spezifität. Darüber hinaus verkürzte es die Inkubationszeit des Herpes-simplex-Virus Typ 1 um etwa 48 Stunden und die des Enzephalomyokarditis-Virus um etwa 20 Stunden. Der fleckenfreie Test sollte für den Einsatz in der Virologieforschung, der Impfstoffentwicklung und der klinischen Diagnose geeignet sein.

Virusinfektionen können weltweit Millionen von Menschen durch Infektionskrankheiten wie Influenza, Humanes Immundefizienzvirus und Humanes Papillomavirus1 betreffen. Die US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten schätzten, dass das Influenzavirus seit 2010 allein in den Vereinigten Staaten zu 16–53 Millionen Erkrankungen, 0,2–1 Million Krankenhauseinweisungen und 16.700–66.000 Todesfällen geführt hat2,3. Darüber hinaus hat die COVID-19-Pandemie, die weltweit mehr als 500 Millionen Infektionen und mehr als 6 Millionen Todesfälle verursacht hat, eine enorme Belastung für die öffentliche Gesundheit und die sozioökonomische Entwicklung vieler Länder mit sich gebracht4. Um bei der Bewältigung dieser globalen Gesundheitsherausforderungen zu helfen, müssen genaue und kostengünstige Techniken zur Virusquantifizierung für die klinische Diagnose5, die Impfstoffentwicklung6 und die Produktion rekombinanter Proteine7 oder antiviraler Wirkstoffe8,9 entwickelt werden.

Der 1952 entwickelte Plaque-Assay war die erste Methode zur Quantifizierung von Viruskonzentrationen. Der von Renato Dulbecco entwickelte Assay ermöglicht die manuelle Bestimmung der Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFUs) in einer bestimmten Probe, die replikationskompetente lytische Virionen enthält10,11. Diese Proben werden seriell verdünnt und Aliquots jeder Verdünnung werden in eine Schale mit kultivierten Zellen gegeben10. Wenn das Virus benachbarte Zellen infiziert und sich ausbreitet, bildet sich nach und nach eine Plaque, die von einem Experten visuell untersucht werden kann. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit, die Infektiosität der Virusproben auf kostengünstige Weise zu ermitteln, bleibt der Plaque-Assay trotz der Existenz anderer Methoden die Goldstandardmethode zur Quantifizierung von Viruskonzentrationen12,13,14,15,16,17 ,18,19, wie die Immunfluoreszenz-Fokalbildungstests14, die Polymerasekettenreaktion16 und enzymgebundene Immunoassay-basierte Tests19,20. Allerdings benötigen Plaque-Assays in der Regel eine Inkubationszeit von 2–14 Tagen (abhängig von der Art des Virus und den Kulturbedingungen)21, damit sich die Plaques auf sichtbare Größen ausdehnen können, und unterliegen menschlichen Fehlern während des manuellen Plaque-Zählungsprozesses22. Um die herkömmlichen Plaque-Assays zu verbessern, wurden zahlreiche Methoden entwickelt23. Obwohl viele Systeme über einzigartige Möglichkeiten zur Abbildung von Zellkulturen in Wellplatten verfügen, erfordern sie entweder Fluoreszenzmarker22 oder spezielle Kulturplatten mit Goldmikroelektroden24. Darüber hinaus stellen menschliche Zählfehler nach wie vor ein Problem für diese Methoden dar. Ein genauer, quantitativer, automatisierter, schneller und kostengünstiger Plaque-Assay wäre daher für die Virologieforschung und damit verbundene klinische Anwendungen von Vorteil.

Einige der jüngsten Entwicklungen in den Bereichen Quantitative Phase Imaging (QPI), Holographie und Deep Learning bieten die Möglichkeit, diesem Bedarf gerecht zu werden. QPI ist ein herausragendes Bildgebungsverfahren, das die Visualisierung und Quantifizierung transparenter biologischer Proben auf nicht-invasive und markierungsfreie Weise ermöglicht25,26. Darüber hinaus kann die Bildqualität von QPI-Systemen mithilfe neuronaler Netze verbessert werden, indem insbesondere die Phasenwiederherstellung27, die Rauschunterdrückung28, die Autofokussierung29,30 und die räumliche Auflösung31 verbessert werden. Darüber hinaus wurden zahlreiche Deep-Learning-basierte Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Mikroorganismen mithilfe von QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42 gezeigt.

Hier berichten wir über einen kostengünstigen und kompakten, markierungsfreien Live-Plaque-Assay, der automatisch eine wesentlich schnellere quantitative PFU-Auslesung als herkömmliche Virus-Plaque-Assays liefern kann, ohne dass eine Färbung erforderlich ist. Wir haben einen kompakten, linsenfreien holographischen Bildgebungsprototyp (Abb. 1 und Zusatzvideo 1) gebaut, um die räumlich-zeitlichen Merkmale der Ziel-PFUs während ihrer Inkubation abzubilden. Die Gesamtkosten für die Teile dieses gesamten Bildgebungssystems betragen weniger als 880 US-Dollar, ohne einen Standard-Laptop-Computer. Dieses linsenlose holographische Bildgebungssystem scannt jede Stunde schnell die gesamte Fläche einer Sechs-Well-Platte (bei einem Durchsatz von ~0,32 Gigapixel pro Scan eines Testwells) und die rekonstruierten Phasenbilder der Probe werden für die PFU-Detektion verwendet auf den räumlich-zeitlichen Veränderungen, die innerhalb der Bohrlöcher beobachtet wurden. Anschließend haben wir einen auf einem neuronalen Netzwerk basierenden Klassifikator trainiert und ihn verwendet, um die rekonstruierten Phasenbilder in PFU-Wahrscheinlichkeitskarten umzuwandeln, die dann verwendet wurden, um die Positionen und Größen der PFUs innerhalb der Wellplatte aufzudecken. Um die Wirksamkeit unseres Systems zu beweisen, haben wir es auf die Früherkennung des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV), des Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) und des Enzephalomyokarditis-Virus (EMCV) auf Vero E6-Zellplatten getestet. Unser fleckenfreies Gerät konnte die ersten Zelllyseereignisse aufgrund der VSV-Replikation bereits 5 Stunden nach der Inkubation automatisch erkennen und eine PFU-Erkennungsrate von >90 % in <20 Stunden erreichen, was im Vergleich zu herkömmlichen Plaque-Assays eine erhebliche Zeitersparnis darstellt , die ≥48 Stunden dauern. Darüber hinaus zeigen wir eine durchschnittliche Inkubationszeitersparnis von ~48 Stunden bzw. ~20 Stunden für HSV-1 und EMCV, wodurch eine PFU-Erkennungsrate von >90 % bei 100 % Spezifität erreicht wird. Es wurde auch ein quantitativer Zusammenhang zwischen der inkubierten Viruskonzentration und der virusinfizierten Fläche auf der Zellmonoschicht entwickelt. Ohne zusätzliche Probenvorbereitungsschritte kann dieses Deep-Learning-fähige, markierungsfreie PFU-Bildgebungs- und Quantifizierungsgerät mit verschiedenen Plaque-Assays in der Virologie verwendet werden und könnte dazu beitragen, die Forschung in der Impfstoff- und Arzneimittelentwicklung zu beschleunigen.

a, Foto des fleckenfreien PFU-Bildgebungssystems, das die Phasenbilder des Plaque-Assays mit einem Durchsatz von ~0,32 Gigapixel pro Scan jeder Testvertiefung erfasst. Die Verarbeitung jedes Testschachts mithilfe des PFU-Klassifizierungsnetzwerks dauert ca. 7,5 Minuten pro Schacht, wobei die holographischen Phasenbilder des Schachts automatisch in eine PFU-Wahrscheinlichkeitskarte umgewandelt werden (Abb. 2). b, Detaillierte Darstellung der Systemkomponenten. c, Eine Plattenprobe mit sechs Vertiefungen mit Belüftungslöchern auf der Abdeckung und seitlich versiegeltem Parafilm. Siehe auch Zusatzvideo 1.

Um die Wirksamkeit des Geräts zu demonstrieren, haben wir 14 Plaque-Assays mit Vero E6-Zellen und VSV vorbereitet. Die Probenvorbereitungsschritte erfolgten nach Standard-Plaque-Assays und sind in Abb. 2a zusammengefasst (Einzelheiten siehe Methoden). Für jede Platte mit sechs Vertiefungen wurden ca. 6,5 × 105 Zellen in jede Vertiefung ausgesät, die dann 24 Stunden lang in einem Inkubator (Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator, Thermo Scientific) inkubiert wurden, um eine Zellmonoschicht mit einer Bedeckung von > 95 % zu erreichen. Während der Virusinfektion wurden fünf Vertiefungen mit 100 µl der verdünnten VSV-Suspension (erhalten durch Verdünnen einer 6,6 × 108 PFU ml–1 VSV-Stammlösung mit einem Verdünnungsfaktor von 2–1 × 10–6) infiziert und eine Vertiefung blieb übrig zur Negativkontrolle. Dann wurden 2,5 ml der Overlay-Lösung, die das Gesamtmedium mit 4 % Agarose enthielt, in jede Vertiefung gegeben (Einzelheiten finden Sie unter „Methoden“, „Vorbereitung der Agarose-Overlay-Lösung“). Nach der Verfestigung des Überzugs bei Raumtemperatur wurde jede Probe zunächst für eine 20-stündige Inkubation in unseren Bildgebungsaufbau gegeben, wobei eine Zeitrafferbildgebung durchgeführt wurde, um die räumlich-zeitlichen Informationen der Probe zu erfassen. Anschließend wurde dieselbe Probe weitere 28 Stunden im Inkubator belassen, damit die PFUs auf ihre optimale Größe für den herkömmlichen Plaque-Assay wachsen konnten (dies dient nur zu Vergleichszwecken). Abschließend wurde jede Probe mit einer Kristallviolettlösung gefärbt, um als Grundlage für den Vergleich mit unserer markierungsfreien Methode zu dienen.

a, Arbeitsablauf bei der Probenvorbereitung für den Plaque-Assay. Der herkömmliche Plaque-Assay im letzten Schritt wird nur zu Vergleichszwecken durchgeführt und ist für den Betrieb des vorgestellten PFU-Detektionsgeräts nicht erforderlich. b–f, Detaillierte Bild- und Datenverarbeitungsschritte für den Live-Virus-Plaque-Assay. b, Ein Bildvorverarbeitungsschritt, der die aufeinanderfolgenden Whole-Well-Hologramme rekonstruiert und registriert. Ein auf einem neuronalen Netzwerk basierender PFU-Klassifikator wird scannend verwendet, um die Hologramme in eine PFU-Wahrscheinlichkeitskarte umzuwandeln. c, Ein Beispiel für die Netzwerkverarbeitung in einer lokalen Region. d, Ein Beispiel für eine Single-Well-PFU-Wahrscheinlichkeitskarte. e, Nach Verwendung eines Schwellenwerts von 0,5 wird die PFU-Wahrscheinlichkeitskarte in d in das PFU-Erkennungsergebnis umgewandelt. f, Ein Beispiel für das PFU-Erkennungsergebnis einer gesamten Sechs-Well-Platte.

Um den netzwerkbasierten VSV-PFU-Klassifikator zu trainieren und zu testen, wurden 54 Vertiefungen (d. h. 45 positive Vertiefungen und 9 negative Vertiefungen) zum Training und 30 Vertiefungen (d. h. 25 positive Vertiefungen und 5 negative Vertiefungen) zum Testen verwendet . Während der Trainingsphase wurde ein auf maschinellem Lernen basierender grober PFU-Lokalisierungsalgorithmus entwickelt, um sowohl die Generierung des Trainingsdatensatzes zu beschleunigen als auch die potenziellen Fehlalarme abzugrenzen (Einzelheiten siehe Methoden). Nachdem dieser PFU-Lokalisierungsalgorithmus jede Probe überprüft hatte, wurden die resultierenden PFU-Kandidaten mithilfe einer speziell entwickelten grafischen Benutzeroberfläche manuell weiter zur Bestätigung untersucht (ergänzende Abbildung 1). Diese manuelle Prüfung diente lediglich während der Trainingsphase dazu, die Trainingsdaten korrekt und effizient aufzubereiten. Der negative Trainingsdatensatz wurde ausschließlich aus der Negativkontrollvertiefung jeder Wellplatte bevölkert. Insgesamt wurden 357 echt positive holografische PFU-Videos und 1.169 negative holografische Videos für das Training des neuronalen PFU-Entscheidungsnetzwerks gesammelt. Dieser Datensatz wurde weiter erweitert, um insgesamt 2.594 positive und 3.028 negative holografische Videos (Methoden) zu erstellen, wobei jedes Bild 480 × 480 Pixel hatte und das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden holografischen Bildern 1 Stunde betrug.

Nachdem der auf einem neuronalen Netzwerk basierende VSV-PFU-Klassifikator trainiert wurde, wurde er blind an allen 30 Testbrunnen scannend getestet (Abb. 2b), ohne dass der PFU-Lokalisierungsalgorithmus erforderlich war, der nur für die Trainingsdatengenerierung verwendet wurde. Für jede Testvertiefung haben wir ca. 18.000 × 18.000 effektive Pixel (was einer aktiven Fläche von 30 × 30 mm2 nach Verwerfen der Kanten entspricht); Die digitale Verarbeitung jedes Testschachts mithilfe des PFU-Klassifizierungsnetzwerks (Abb. 2c) dauert ca. 7,5 Minuten, wodurch die holographischen Phasenbilder des Schachts automatisch in eine PFU-Wahrscheinlichkeitskarte umgewandelt werden (Abb. 2d). Jedes Pixel der Vertiefung auf dieser Karte gibt die statistische Wahrscheinlichkeit an, dass der lokale Bereich (0,8 × 0,8 mm2), der um dieses Pixel zentriert ist, eine PFU aufweist. Unter Verwendung eines Wahrscheinlichkeitsschwellenwerts von 0,5 wurde das endgültige Ergebnis der PFU-Erkennung und -Quantifizierung über den gesamten Bereich der Testvertiefung erhalten (z. B. Abb. 2e, f). Die Auswirkung dieses Wahrscheinlichkeitsschwellenwerts wird in der ergänzenden Abbildung 2 und der ergänzenden Anmerkung 1 analysiert und diskutiert, die den Kompromiss zwischen der Spezifität und der Sensitivität durch Auswahl verschiedener Schwellenwerte veranschaulicht.

Abbildung 3a zeigt Beispiele für die Leistung des Geräts beim Nachweis von VSV-PFUs nach 17-stündiger Inkubation, was einen kritischen Zeitpunkt darstellt, in dem die Nachweisrate 90 % übersteigt (ergänzende Abbildung 3 zeigt auch unsere Nachweisergebnisse nach 15-stündiger und 20-stündiger Inkubation, berichtet für Vergleich). Drei repräsentative PFUs werden ebenfalls ausgewählt und in Abb. 3b dargestellt. Wenn sich eine PFU in einem frühen Wachstumsstadium befindet und ihre Größe viel kleiner als unser virtuelles Scanfenster von 0,8 × 0,8 mm2 ist, erscheint sie im endgültigen Erkennungsergebnis als Quadrat (dargestellt durch PFU1 in Abb. 3b), was effektiv der Fall ist zweidimensionale (2D) räumliche Faltung der kleinräumigen PFU mit unserem Scanfenster. Als weiteres Beispiel zeigt PFU3 ein Clusterbildungsereignis, bei dem zwei benachbarte PFUs mit unserer Methode leicht unterschieden werden können, im Gegensatz zum herkömmlichen Plaque-Assay, bei dem sie physisch zu einem verschmolzen. Abbildung 3c zeigt außerdem die von unserem Gerät erzielte PFU-Quantifizierung im Vergleich zu den 48-Stunden-Ergebnissen des traditionellen Plaque-Assays. Wir erreichten eine Erkennungsrate von >90 % nach 20-stündiger Inkubation, ohne dass es zu irgendeinem Zeitpunkt falsch positive Ergebnisse gab, obwohl keine Färbung verwendet wurde.

a: Whole-Well-Vergleich des fleckenfreien viralen Plaque-Assays nach 17-stündiger Inkubation mit dem herkömmlichen Plaque-Assay nach 48-stündiger Inkubation und Färbung. b, Das Wachstum von drei vorgestellten PFUs in der positiven Vertiefung von a. Der rekonstruierte Phasenkanal wird mit der mithilfe des PFU-Lokalisierungsalgorithmus generierten Maske überlagert, um ihre Positionen besser sichtbar zu machen. c, Durchschnittliche PFU-Erkennungsrate mit dem markierungsfreien viralen Plaque-Assay. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung über die fünf Testplatten.

Wir haben unsere Ergebnisse auch mit einem weit verbreiteten automatischen PFU-Zählsystem verglichen, das im Handel erhältlich ist. Nach der 48-stündigen Inkubation, gefolgt vom Standard-Färbeprotokoll, bildeten wir dieselben fünf Testplatten mit sechs Vertiefungen (VSV, Abb. 3c) ab, diesmal mit dem Agilent BioTek Cytation 5-Gerät (Agilent Technologies). Nach der automatisierten Bilderfassung mit diesem System wurde die PFU-Erkennung von der Gen 5-Software (Agilent Technologies) unter Verwendung der optimierten Einstellungen ihres automatischen PFU-Zählalgorithmus (Methoden) durchgeführt. Es wurde eine Erkennungsrate von 94,3 % bei einer Falscherkennungsrate von 1,2 % erreicht. Im Vergleich dazu erreichte die vorgestellte fleckenfreie holographische Methode eine PFU-Erkennungsrate von 93,7 % mit einer Falscherkennungsrate von 0 % nach 20 Stunden Inkubation für dieselben Proben (d. h. 28 Stunden früher im Vergleich zur Standardinkubationszeit). Dieses kommerziell erhältliche automatisierte PFU-Zählsystem ließ nicht nur einige der spät wachsenden PFUs fehlen und führte zu einigen falsch positiven Ergebnissen, sondern zeigte auch eine Übersegmentierung bei großen PFUs und eine Untererkennung von PFUs bei Proben mit hohen Viruskonzentrationen. Ein detaillierter Bericht der überzählten, falsch negativen und falsch positiven PFUs und eine visualisierte Zusammenfassung der PFU-Erkennungsleistung dieser Standarderkennungsmethode im Vergleich zu unserem Gerät sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt.

Unser vorgestelltes Framework spart nicht nur Inkubationszeit und ist fleckenfrei, sondern weist auch eine starke Generalisierungsfähigkeit auf. Beispielsweise kann es nach dem Training mit Sechs-Well-Platten direkt auf 12-Well-Platten verwendet werden, ohne dass Modifikationen oder Umschulungsschritte erforderlich sind (siehe „Vorbereitung der Well-Platten“). Ohne Transfer-Lernschritte erreichten wir im Blindtest auf einer 12-Well-Platte eine PFU-Erkennungsrate von 89 % nach 20 Stunden Inkubation (VSV) (ergänzende Abbildung 5). Darüber hinaus kann unser rechnergestütztes PFU-Erkennungsgerät verallgemeinern, um andere Virustypen (z. B. HSV-1 und EMCV) durch Transferlernen zu erkennen, während das VSV-PFU-Erkennungsnetzwerk als Basismodell verwendet wird. Für HSV-1 wurden zwei Platten mit sechs Vertiefungen für das Transferlernen (Methoden) vorbereitet, 72 Stunden lang mit einem Bildgebungsintervall und -zeitraum von 2 Stunden abgebildet und insgesamt 120 Stunden lang weiter inkubiert, um die gefärbten Ground-Truth-PFU-Proben zu erhalten . Die gesammelten Daten wurden verwendet, um den Trainingsdatensatz für das Transferlernen zu füllen. Das resultierende neuronale HSV-1-Netzwerk wurde blind an 12 zusätzlichen HSV-1-Testvertiefungen getestet (die insgesamt 214 HSV-1-PFUs und zwei Negativkontrollvertiefungen enthielten); Wie in der ergänzenden Abbildung 6 gezeigt, erreichte unser Framework ohne die Einführung falsch-positiver Ergebnisse eine Erkennungsrate von 90,4 % nach 72 Stunden und verkürzte damit die Inkubationszeit um 48 Stunden im Vergleich zu den 120 Stunden, die beim herkömmlichen HSV-1-Plaque-Assay erforderlich sind43. In ähnlicher Weise wurden für EMCV drei Sechs-Well-Platten zum Transferlernen („Well-Plattenvorbereitung“) verwendet, die 60 Stunden lang mit einem Bildgebungsintervall von 1 Stunde abgebildet und nach 72 Stunden Gesamtinkubation gemäß den Standardprotokollen gefärbt wurden. Beim Test an 12 zusätzlichen EMCV-Testvertiefungen (die insgesamt 249 EMCV-PFUs und zwei negative Kontrollvertiefungen enthielten) wurde nach 52 Stunden Inkubation eine Erkennungsrate von 90,8 % mit 0 % falsch positiven Ergebnissen erzielt, wie in der ergänzenden Abbildung 7 gezeigt Dies führt zu einer Inkubationszeitersparnis von 20 Stunden im Vergleich zu 72 Stunden beim herkömmlichen EMCV-Plaque-Assay44. Bemerkenswert ist, dass die EMCV-Platten im Vergleich zu VSV oder HSV-1 viel mehr spät wachsende PFUs enthalten, was auch mit früheren Beobachtungen übereinstimmt45. Das vorgestellte Framework erzielte eine zuverlässige EMCV-Plaque-Zählleistung selbst für die PFU-Zusammenführungsregionen einer Testvertiefung, wie in der ergänzenden Abbildung 7c dargestellt. Aufgrund der auf der raumzeitlichen Merkmalsanalyse basierenden Früherkennungsfähigkeit des fleckenfreien Systems konnte es jede einzelne PFU innerhalb dieser verschmelzenden PFU-Regionen in den frühen Phasen des Plaquewachstums identifizieren und so falsche Negative oder Fehler beseitigen, die bei Standard-PFU aufgetreten sein könnten Zählmethoden aufgrund der Ausbreitung früherer PFUs, wodurch die spät wachsenden Plaques räumlich abgedeckt (und verdeckt) werden.

Das vorgestellte Gerät ist kostengünstig, kompakt und automatisiert und kann auch einen größeren Viruskonzentrationsbereich mit einer zuverlässigeren PFU-Anzeige verarbeiten. Um dies zu demonstrieren, haben wir einen weiteren Satz Fünf-Titer-Testplatten vorbereitet, wobei für jede Platte alle sechs Vertiefungen mit VSV infiziert waren, jedoch mit einem zweifachen Verdünnungsunterschied zwischen den einzelnen Vertiefungen, wodurch ein großer dynamischer Bereich der Viruskonzentration aus einem Test abgedeckt wurde gut zu einem anderen. Wie in Abb. 4 gezeigt, ist unsere Methode auch für Fälle mit höherer Viruskonzentration wirksam; siehe zum Beispiel die Verdünnungsfälle von 2−2 × 10−4 und 2−3 × 10−4. Im herkömmlichen 48-Stunden-Plaque-Assay ist aufgrund der starken räumlichen Überlappung nur die niedrigste Viruskonzentration für die PFU-Quantifizierung geeignet, wohingegen wir bei unserem markierungsfreien Gerät die einzelnen PFUs bereits in einem frühen Stadium automatisch und genau zählen können, selbst für die höchste Viruskonzentration (Abb. 4c).

a,b, Gesamtplattenvergleich des fleckenfreien viralen Plaque-Assays nach 15-stündiger Inkubation (a) mit dem herkömmlichen Plaque-Assay nach 48-stündiger Inkubation und Färbung (b). c: Das Wachstum von PFUs in ihrem frühen Stadium für dieselbe Platte, wie in a und b gezeigt.

Darüber hinaus bietet unsere Methode eine zuverlässigere Anzeige; Beispielsweise wurde im eingekreisten Bereich in Abb. 4a, b das Fehlen von Zellen durch einige zufällige Probleme mit der Lebensfähigkeit der Zellen verursacht, die während des Plaque-Assays auftraten. In unserem Gerät können diese Artefakte leicht von den durch die Virusreplikation verursachten Zelllyseereignissen unterschieden werden, da die räumlich-zeitlichen Muster für diese beiden Ereignisse sehr unterschiedlich sind (bewertet durch das trainierte PFU-Wahrscheinlichkeitsnetzwerk). Dies macht das Deep-Learning-fähige Gerät widerstandsfähig gegenüber potenziellen Artefakten oder Zelllebensfähigkeitsproblemen, die zufällig während der Probenvorbereitungsschritte auftreten.

Aufgrund der hohen Viruskonzentration, die in diesen Fünf-Titer-Testproben verwendet wurde, kam es schnell zu einer Häufung der PFUs und war nicht mehr für die manuelle Zählung geeignet, wie in Abb. 5a dargestellt. Mithilfe der quantitativen Anzeige und der PFU-Wahrscheinlichkeitskarte des Geräts konnten wir jedoch die Fläche der virusinfizierten Regionen zu allen Zeitpunkten während der Inkubationszeit ermitteln, wie in Abb. 5b dargestellt. Um dies besser zu veranschaulichen, tragen wir in Abb. 5c den Virusverdünnungsfaktor gegenüber dem Verhältnis der infizierten Zellfläche pro Testvertiefung (in %) für alle Proben nach 6, 8 und 10 Stunden Inkubationszeit auf. Trotz einiger serieller Verdünnungsfehler, später Virusaktivierungen und PFU-Cluster-Ereignissen nimmt der vom Gerät gemessene Prozentsatz der infizierten Fläche mit zunehmendem Verdünnungsfaktor für alle Inkubationszeiten monoton ab. Dies legt nahe, dass durch die Kalibrierung des Systems die Viruskonzentration (PFU ml−1) auch aus dem Prozentsatz der infizierten Zellfläche pro Vertiefung geschätzt werden kann.

a, PFU-Zählergebnisse für verschiedene hochkonzentrierte Virusproben zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Der hellrote Bereich zeigt den Zeitpunkt an, als die PFUs stark geclustert waren und nicht mehr für die Zählung geeignet waren. b, Fläche der virusinfizierten Regionen für Proben mit unterschiedlich hoher Viruskonzentration zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Datenpunkte in a und b zeigen die Mittelwerte über Fünf-Titer-Testplatten. Die Fehlerbalken in a und b zeigen den Standardfehler auf Fünf-Titer-Testplatten. c, Diagramme des Virusverdünnungsfaktors im Vergleich zum Verhältnis der infizierten Zellfläche pro Testvertiefung (in %) für alle Fünf-Titer-Testproben nach 6, 8 und 10 Stunden Inkubationszeit.

Darüber hinaus kann das vorgestellte Framework unter Verwendung des Flächenprozentsatzes der virusinfizierten Region als markierungsfreie Quantifizierungsmetrik frühere PFU-Auslesungen liefern. Um dies zu zeigen, haben wir den Prozentsatz der infizierten Fläche für alle 25 positiven oder infizierten Vertiefungen der Blindtestplatten berechnet, die zur Erstellung von Abb. 3c verwendet wurden. Wie in Abb. 6 dargestellt, kann eine schnellere Anzeige der PFU-Konzentration nach 12 oder 15 Stunden erfolgen, wenn der Prozentsatz der infizierten Fläche ausreichend groß ist (>1 %). Da die Größe einer durchschnittlichen PFU in der Vertiefung nach 15 Stunden Inkubation physikalisch größer ist als nach 12 Stunden, ist die Steigung der roten Kalibrierungskurve in Abb. 6b erwartungsgemäß kleiner als in Abb. 6a. Bei Proben mit noch höheren Viruskonzentrationen könnte der Prozentsatz der infizierten Zellfläche in ≤ 10 Stunden Inkubation > 1 % erreichen (dargestellt in Abb. 5c), wodurch die PFU-Konzentration noch früher angezeigt wird.

a,b, Prozentsatz der infizierten Fläche nach 12 Stunden (a) und nach 15 Stunden (b). Die Viruskonzentrationen auf der y-Achse wurden aus dem traditionellen 48-Stunden-Plaque-Assay für jede Testvertiefung ermittelt. Verschiedene Testvertiefungen derselben Platte wurden mit derselben Farbe und denselben Symbolen markiert. In jeder Parzelle gibt es 25 infizierte Testbrunnen. Die roten Kalibrierungskurven wurden durch quadratische Polynomanpassung erhalten.

Wir haben ein kostengünstiges und automatisiertes PFU-Früherkennungssystem gezeigt, das ein linsenloses holographisches Bildgebungssystem und Deep Learning verwendet. Dieses Deep-Learning-basierte fleckenfreie Gerät erfasst Zeitraffer-Phasenbilder einer Testvertiefung mit einem Durchsatz von ca. 0,32 Gigapixeln pro Scan, die dann von einem neuronalen PFU-Quantifizierungsnetzwerk in ca. 7,5 Minuten verarbeitet werden, um die PFU-Verteilung zu erhalten jedes Testbrunnens. Die in Abb. 3c dargestellte hohe Erkennungsrate dieses markierungsfreien Geräts mit 100 % Spezifität ist eine konservative Schätzung, da die Grundwahrheitsdaten nach 48-stündiger Inkubation ermittelt wurden. In den frühen Stadien der Inkubationszeit waren viele VSV-PFUs noch nicht einmal physisch vorhanden, was zu einer Untererkennung führte (eine Erkennungsrate von 80,1 % bzw. 90,3 % nach 15 bzw. 17 Stunden Inkubation). Das bedeutet, dass die Erkennungsrate sogar noch höher wäre, wenn wir zu jedem Zeitpunkt die vorhandenen PFUs als Grundlage für die Quantifizierung verwenden würden.

Der Kern des fleckenfreien PFU-Erkennungssystems liegt in der effektiven Kombination von digitaler Holographie und Deep Learning. Der Einsatz des linsenfreien holographischen Bildgebungssystems ist für die Abbildung ungefärbter Zellen in einem kompakten Inkubator von wesentlicher Bedeutung und liefert die räumlich-zeitlichen Phaseninformationen der Proben mithilfe eines kompakten, kostengünstigen Bildgebungssystems mit hohem Durchsatz. Für einen gegebenen Zeitstempel des Bildgebungssystems würden die PFU-Regionen im Allgemeinen eine breitere Phasenverteilung im Vergleich zu den Nicht-PFU-Regionen aufweisen; Darüber hinaus würde eine bestimmte PFU-Region typischerweise größere Phasenänderungen über verschiedene Zeitpunkte hinweg aufweisen (einige Beispiele finden Sie in der ergänzenden Abbildung 8). Diese einzigartigen räumlich-zeitlichen Signaturen, die im Phasenkanal der holografischen, markierungsfreien Zeitrafferbilder vorhanden sind, sind für das tiefe neuronale Netzwerk von entscheidender Bedeutung, um die Ziel-PFU-Regionen von Nicht-PFU-Regionen zu früheren Zeitpunkten statistisch zu identifizieren, ohne falsch positive Ergebnisse einzuführen oder Unterzählung aufgrund räumlicher Überschneidungen. Darüber hinaus haben uns das große Sichtfeld (FOV) der linsenlosen holografischen On-Chip-Bildgebungskonfiguration mit Einheitsstreifenvergrößerung und die Fähigkeit zur digitalen Fokussierung ohne Autofokus-Hardware oder Objektivlinse dabei geholfen, einen großen Phaseninformationsdurchsatz zu erreichen von ~0,32 Gigapixeln in <30 s pro Testvertiefung (mit einem Sichtfeld von ~30 × 30 mm2) mithilfe eines kompakten und kostengünstigen Geräts, das ohne größere Modifikationen in jeden Standard-Inkubator passt. Dies ermöglichte es uns, eine gesamte Platte mit sechs Vertiefungen innerhalb von 3 Minuten schnell zu scannen. Dadurch kann das Gerät die PFU-Proben möglicherweise sogar häufiger als jede Stunde scannen, was möglicherweise weitere Zeiteinsparungen bei der PFU-Erkennung durch feinere räumlich-zeitliche Änderungen ermöglicht könnte mit einer kürzeren Bildgebungsdauer erlernt werden. Ein solcher Ansatz wäre mit dem Nachteil verbunden, dass wesentlich mehr Trainingsdaten und Rechenzeit erforderlich wären.

Darüber hinaus können aufgrund der axialen Defokusstoleranz der Deep-Learning-basierten PFU-Erkennungsmethode die Bildrekonstruktionsschritte (die sich über mehrere Stunden automatisierter Zeitrafferaufnahmen in einem Inkubator erstrecken) durch die Ausbreitung der erfassten linsenfreien Hologramme weiter vereinfacht werden auf einen festen axialen Abstand zwischen Probe und Sensor für das gesamte Bohrloch, ohne die PFU-Erkennungsergebnisse zu beeinträchtigen und gleichzeitig einen hohen Durchsatz sicherzustellen (Ergänzende Anmerkung 3 und ergänzende Abbildung 9 zeigen die Defokussierungsabstandstoleranz unseres Systems).

Darüber hinaus erfordert das rechnergestützte holographische PFU-Erkennungsgerät vernachlässigbare Änderungen an den standardmäßigen Probenvorbereitungsschritten, die in herkömmlichen Plaque-Assays verwendet werden, während der Färbeprozess vollständig übersprungen wird. Die Temperatur-, Brechungsindex- und optischen Feldänderungen im Inkubator, die beispielsweise durch Verdunstung oder Blasenbildung verursacht werden, haben einen vernachlässigbaren Einfluss auf die PFU-Erkennungsleistung dieses Systems, da solche Artefakte und statistischen Variationen während der Trainingsexperimente gelernt werden. Dabei hilft es den trainierten neuronalen Netzen, die räumlich-zeitlichen Merkmale der echten PFUs, die der Virusreplikation entsprechen, von solchen Fluktuationen und physikalischen Störungen innerhalb der Inkubatorumgebung zu unterscheiden, die natürlicherweise über mehrere Stunden hinweg auftreten. Darüber hinaus hat das holographische Zeitraffer-Bildgebungssystem keinen negativen Einfluss auf den Plaquebildungsprozess in den Testvertiefungen oder führt zu einer Verzerrung desselben, was anhand von Kontrollexperimenten validiert wird, wie in der ergänzenden Abbildung 10 gezeigt.

Der modulare Aufbau des PFU-Erkennungssystems bietet Potenzial für weitere Systemverbesserungen. Beispielsweise kann eine parallele Bildgebung durch die Installation mehrerer Bildsensoren im selben System erreicht werden, ohne die Kosten des Geräts wesentlich zu erhöhen, was seinen effektiven Bilddurchsatz von 30 cm2 min-1 weiter verbessert46. Genauere Scanschritte können auch dazu beitragen, die bei der Bildvorverarbeitung erforderlichen Bildregistrierungsschritte zu reduzieren. Eine Multiwellenlängen-Phasenwiederherstellung47 kann ebenfalls implementiert werden, um die Gesamtbildqualität der markierungsfreien Plaques zu verbessern. Das Deep-Learning-fähige PFU-Erkennungs-Framework kann möglicherweise an andere Bildgebungsmodalitäten angepasst werden, die zur Messung räumlich-zeitlicher Unterschiede in den PFU-Regionen für verschiedene Virustypen verwendet werden können; Ebenso ist das trainierte PFU-Klassifikatornetzwerk auch an diese Systemänderungen anpassbar (Ergänzende Anmerkung 2).

Zusammenfassend haben wir die Leistung eines fleckenfreien, schnellen und quantitativen Virus-Plaque-Assays gezeigt, der Deep Learning und Holographie nutzt. Das kompakte und kostengünstige Gerät bewahrt alle Vorteile der herkömmlichen Plaque-Assays und reduziert gleichzeitig die erforderliche Probeninkubationszeit auf markierungsfreie Weise erheblich, wodurch Zeit gespart und die Notwendigkeit einer Färbung entfällt. Es ist außerdem resistent gegenüber potenziellen Artefakten während der Probenvorbereitung und kann automatisch einen größeren dynamischen Bereich von Viruskonzentrationen pro Well quantifizieren. Wir gehen davon aus, dass diese Technik in der Virologieforschung, der Impfstoffentwicklung und verwandten klinischen Anwendungen weit verbreitet sein wird.

Wir haben alle Zellkulturen und Viren während unserer Experimente in unserem Labor der Biosicherheitsstufe 2 gemäß den Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsregeln und -vorschriften der University of California, Los Angeles, gehandhabt. Alle Vorgänge wurden unter streng aseptischen Bedingungen durchgeführt.

Wir verwendeten Vero C1008 (Vero 76, Klon E6, Vero E6) (ATCC CRL-1586) (American Type Culture Collection (ATCC)), VSV (ATCC VR-1238), HSV-1 (ATCC VR-260) und EMCV ( ATCC VR-129B). Vero-E6-Zellen sind Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze und Epithelzellen.

Wir haben die gefrorene Stammkultur unmittelbar nach der Lieferung der gefrorenen Stammkultur von ATCC sofort in den flüssigen Stickstoffdampf gegeben, bis sie gebrauchsfertig war. Als Basismedium für die Zelllinie wurde das von ATCC formulierte Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (Produktnummer 30-2003, ATCC) verwendet. Für das vollständige Wachstumsmedium wurde das Basismedium mit fötalem Rinderserum (FBS) (Produktnummer 30-2021, ATCC) mit einer Endkonzentration von 10 % gemischt. Die FBS-Stammlösung wurde in 4-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Für die Zellkultivierung verwendeten wir Gewebekulturflaschen (75 cm2 Fläche, belüfteter Deckel, mit Gewebekultur behandelt, T-75) (Produktnummer FB012937, Fisher Scientific). Das Basismedium in einem T-75-Kolben und FBS wurden im Inkubator (Produktnummer 51030400, ThermoFisher Scientific) auf 37 °C gebracht und mit 5 % CO2 gefüttert, bevor es für die Zellkultivierungsschritte gehandhabt wurde. Das komplette Wachstumsmedium wurde vorbereitet. Die gefrorene Zellkultur wurde aus dem flüssigen Stickstoff entfernt und unter fließendem Wasser aufgetaut. Nach dem Auftauen der Zellen wurde die Zellsuspension in einen T-75-Kolben gegeben, der 8 ml vollständiges Wachstumsmedium (d. h. EMEM + 10 % FBS) enthielt. Der Kolben wurde bei 37 °C und 5 % CO2 im Inkubator inkubiert. Die Anhaftung der Zellen an der Kolbenoberfläche wurde täglich unter einem Phasenkontrastmikroskop analysiert. Das Medium im Kolben wurde zwei- bis dreimal pro Woche erneuert. Die Zellen wurden im Verhältnis 1:4 subkultiviert, als eine 95-prozentige Konfluenz der Zellen als Monoschicht erreicht war.

Nach der Entfernung des Mediums aus der Zellkulturflasche wurden die Zellen zur Dissoziation der Zellmonoschichten 2–3 ml 0,25 % Trypsin/0,53 mM EDTA (ATCC 30-2101, ATCC) pro Flasche ausgesetzt. Zur schnellen Dissoziation der Zellen wurden die Flaschen 5–6 Minuten im Inkubator aufbewahrt. In jeden Kolben wurden etwa 8 ml Vollmedium gegeben und 2–3 ml der Mischung mit suspendierten Zellen in einen neuen T-75-Kolben überführt. Etwa 8 ml Vollmedium wurden in den neuen Kolben gegeben und nach vorsichtigem Mischen bei 37 °C und 5 % CO2 für das Wachstum neuer Zellen inkubiert.

Nach der Lieferung der Virusstammproben von ATCC wurden diese bis zur weiteren Verwendung in Tanks mit flüssigem Stickstoff gelagert. Für die Virusvermehrung müssen Vero-Zellen kultiviert werden und am Tag der Infektion eine Konfluenz von 90–95 % erreichen. Daher wurden Vero-Zellen vor der Virusvermehrung 1–2 Tage lang kultiviert, wobei eine Samenzellsuspension von Vero-Zellen verwendet wurde, die mehr als dreimal subkultiviert wurden.

Am Tag der Virusinfektion wurde das Wachstumsmedium in der Vero-Zellkulturflasche entfernt und entsorgt. Dann wurde es mit 5 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS), 1x (ATCC 30-2200) (Produktnummer 30-2200, ATCC), gespült. Nachdem der D-PBS-haltige Kolben 3 Minuten lang im Schrank aufbewahrt wurde, wurde die Pufferlösung entfernt und verworfen. Zur Virusvermehrung wurden die Vero-Zellen in jedem Kolben mit 14 µl VSV-Stammvirus, 17 µl HSV-1-Stammvirus oder 20 µl EMCV-Stammvirus mit einer Infektionsmultiplizität von 0,003, 0,07 und 0,05 für das VSV infiziert , HSV-1 bzw. EMCV. Anschließend wurden 6 ml EMEM (ohne FBS) in jeden Kolben gegeben. Die Kolben wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und in Abständen von 15 Minuten geschüttelt, um eine gleichmäßige Ausbreitung des Virusinokulums zu erreichen. Nach 1 Stunde wurden 10 ml komplettes Medium in jeden Kolben gegeben und die Kolben wurden 48 bis 72 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Flaschen unter einem Phasenkontrastmikroskop analysiert. Bei erfolgreicher Virusvermehrung sollten sich die Zellen von der Oberfläche lösen und in der Mischung runde Zellen zu beobachten sein. Die Mischung wurde in einem 50-ml-Röhrchen (Produktnummer 06-443-20, Fisher Scientific) gesammelt und die Röhrchen mit einer Parafilmschicht versiegelt. Die Suspension im Röhrchen wurde 10 Minuten lang bei ~2.600 g unter Verwendung einer Zentrifuge mit Ausschwingrotoren (Produktnummer 22500126, Fisher Scientific) zentrifugiert. Der das Virus enthaltende Überstand wurde aus dem Röhrchen gesammelt und in einem neuen Röhrchen gesammelt. Nach vorsichtigem Mischen des Röhrchens, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten, wurde die Suspension in 1-ml-Kryoröhrchen mit O-Ring (Produktnummer 5000-1012, Fisher Scientific) aliquotiert. Die Röhrchen wurden beschriftet und in Tanks mit flüssigem Stickstoff gelagert.

Etwa 4 % Agarose (Produktnummer MP11AGR0050, Fisher Scientific) in analysenreinem Wasser (Produktnummer 23-249-581, Fisher Scientific) wurden vorbereitet und gut gemischt48. Die Suspension wurde dann in die Glasflaschen aliquotiert. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 121 °C in einem Autoklaven sterilisiert und 50-ml-Aliquots wurden bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Eines der Röhrchen mit 50 ml steriler Agaroselösung wurde etwa 30 Sekunden lang in einem Mikrowellenofen erhitzt. Die Lösung wurde in einem Wasserbad auf 65 °C abgekühlt. Etwa 23,9 ml EMEM-Medium wurden mit 0,6 ml FBS gemischt und auf 50 °C erwärmt. Etwa 3,5 ml Agaroselösung wurden mit einer serologischen 10-ml-Pipette in die erwärmte Mediummischung gegeben und bis zur Verwendung bei 50 °C gehalten.

Zunächst wurden die im Kolben anhaftenden Zellen mit Trypsin resuspendiert. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu erhalten, und 10 µl der Suspension wurden zur Zellzählung unter Verwendung einer Hämozytometerkammer entnommen. Die Zellen wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop gezählt. Entsprechend der Zellzahl wurde die Zellkonzentration durch Verdünnen der Suspension mit dem Vollmedium auf ~6,5 × 105 Zellen pro ml eingestellt. Ungefähr 6,5 × 105 Zellen wurden in jede Vertiefung einer neuen Platte mit sechs Vertiefungen (Produktnummer CLS5316, Corning) gegeben. Anschließend wurden jeder Vertiefung 2 ml Vollmedium zugesetzt und die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 gelagert. Als nächstes wurde die Zellbedeckung in jeder Vertiefung unter dem Mikroskop überprüft. Die Zellabdeckung sollte ~95 % erreichen, um den PFU-Assay durchzuführen.

Für eine bestimmte Platte mit sechs Vertiefungen wurden die Zellen jeder Vertiefung mit 100 µl verdünnter Virussuspension infiziert (die Verdünnungsfaktoren für VSV, HSV-1 und EMCV betragen 2−1 × 10−6, 2−2 × 10−5). bzw. 2–3 × 10–3) und ~2,5–3 ml der Überschichtungslösung wurden zu den Zellen gegeben. Nach der Verfestigung des Überzugs bei Raumtemperatur wurde die Platte in einem Inkubator (Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator, Thermo Scientific) für 48 Stunden, 120 Stunden und 72 Stunden entsprechend VSV, HSV-1 bzw. EMCV inkubiert. Ein Fotovergleich der HSV-1-Proben nach 72 Stunden, 96 Stunden und 120 Stunden Inkubation ist in der ergänzenden Abbildung 11 dargestellt, die die Notwendigkeit einer 120-stündigen Inkubation für HSV-1-PFUs bestätigt. In ähnlicher Weise ist in der ergänzenden Abbildung 12 ein Fotovergleich der EMCV-Proben nach 48 und 72 Stunden Inkubation dargestellt, der die Notwendigkeit einer 72-stündigen Inkubation für EMCV bestätigt. Diese Beobachtungen stimmen auch mit früheren Studien überein43,44.

Die Vorbereitung der 12-Well-Platten, die für den VSV-PFU-Test verwendet wurden, folgte dem gleichen Arbeitsablauf wie die VSV-Vorbereitung der Sechs-Well-Platte. Der einzige Unterschied bei der Vorbereitung von VSV-Platten mit 12 Vertiefungen besteht darin, dass die ausgesäten Zellen in jeder Vertiefung, das Virussuspensionsvolumen pro Vertiefung und die für jede Vertiefung verwendete Agarose-Overlay-Lösung im Vergleich zu den Platten mit sechs Vertiefungen auf die Hälfte reduziert wurden. In der Ergänzungstabelle 2 haben wir die verschiedenen experimentellen Einstellungen zusammengefasst, die für VSV, HSV-1 und EMCV im Prozess der Virusvermehrung und Wellplattenvorbereitung verwendet wurden.

Etwa 0,1 g Kristallviolettpulver (Produktnummer C581-25, Fisher Scientific) wurden mit 40 ml analysenreinem Wasser in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen gemischt. Die Mischung wurde vorsichtig gemischt, um das Pulver aufzulösen. Etwa 10 ml Methanol (Produktnummer A452-4, Fisher Scientific) wurden zu der Mischung gegeben, die dann bei Raumtemperatur gelagert wurde.

Diese Schritte wurden nur zum Vergleich mit den PFU-Messwerten unseres Geräts durchgeführt. Nach 48 Stunden VSV-Inkubation, 120 Stunden HSV-1-Inkubation oder 72 Stunden EMCV-Inkubation wurde die Platte aus dem Inkubator entfernt und die Zellen wurden 30 Minuten lang mit 0,5 ml Methanol-Essigsäure-Lösung fixiert. Nach 30 Minuten wurden die Vertiefungen vorsichtig mit Wasser gewaschen, um die Agaroseschicht zu entfernen. Das überschüssige Wasser wurde entfernt und 1 ml Kristallviolettlösung in jede Vertiefung gegeben. Die Platte mit Kristallviolett wurde in den Schüttelinkubator gegeben und 30 Minuten lang bei 100 U/min gemischt. Nach 30-minütiger Inkubation wurde Leitungswasser verwendet, um überschüssige Flecken von der Platte zu entfernen, und der Abfall wurde in einem großen Becherglas gesammelt. Die Platte wurde unter einem Abzug trocknen gelassen und mit einer Aluminiumfolie abgedeckt bei Raumtemperatur gelagert.

Zur Erfassung der Inline-Hologramme der Proben wurde ein automatischer, linsenloser PFU-Bildgebungsaufbau aufgebaut. Dieser Aufbau umfasst: (1) ein holographisches Bildgebungssystem, (2) eine mechanische 2D-Scanplattform, (3) ein Kühlsystem, (4) einen Steuerkreis und (5) ein automatisches Steuerprogramm. Drei grüne Laserdioden (bei 515 nm, 2 nm Bandbreite, 0,17 mm Emissionsdurchmesser, Osram PLT5510) wurden für die kohärente Beleuchtung verwendet, wobei jede Laserdiode zwei Vertiefungen in derselben Spalte der Probenplatte mit sechs Vertiefungen beleuchtet (Ergänzungsvideo 1). . Die Laserdioden wurden von einem Treiber (TLC5916, Texas Instruments) gesteuert und ca. 16 cm von der Probe entfernt montiert. Ein komplementärer Metalloxid-Halbleiter-Bildsensor (CMOS) (acA3800-14 µm, Basler AG, 1,67 µm Pixelgröße, 6,4 mm × 4,6 mm FOV) wurde ca. 5 mm unter der Probe platziert und bildete ein linsenloses holographisches Bildsystem. Die Phasenänderungen in den PFU-Regionen wurden in den erfassten Hologrammen kodiert.

Es gibt mehrere Faktoren, die die räumliche Auflösung des linsenfreien holographischen Bildgebungssystems beeinflussen, darunter (1) die räumliche Kohärenz der Beleuchtung, (2) die zeitliche Kohärenz der Beleuchtung, (3) der axiale Abstand zwischen der Quellenöffnung und die Probenebene (bezeichnet als z1) und der Abstand zwischen Probe und Sensorebene (z2) und (4) die Pixelgröße des Bildsensors. Als Beleuchtungsquelle pro Well verwendeten wir eine Single-Mode-Laserdiode mit einer Kerngröße von 9 µm und z1 ≈ 16 cm zwischen der Quellenebene und der Probenebene, was für eine ausreichende räumliche Kohärenz sorgte, die die gesamte Probenebene pro Well abdeckte . Für die zeitliche Kohärenzlänge unserer Beleuchtungsquelle gilt:

wobei n der Brechungsindex ist und in Luft gleich 1 ist, λ = 515 nm und Δλ = 2 nm, was die Bandbreite der Laserdiode ist. Wir können dementsprechend die effektive numerische Apertur aufgrund der zeitlichen Kohärenzgrenze des Beleuchtungslichts berechnen als (NAtemporal):

wobei z2 ≈ 5 mm. Diese zeitliche kohärenzbasierte NA ist niedriger als die effektive numerische Apertur, die durch den Abstand zwischen Probe und Sensor und die Ausdehnung der Detektorebene bestimmt wird, und daher kann die zeitliche kohärenzbedingte holographische Auflösungsgrenze unseres Systems angenähert werden als :

Da unser holographisches On-Chip-Bildgebungssystem über \({z_1}\gg {z_2}\) verfügt, arbeitet es mit einer Streifenvergrößerung von 1,49 und die native Pixelgröße (1,67 µm) auf der Sensorebene stellt auch ihre eigene Auflösungsgrenze dar, weil der Pixelierung der erfassten Hologramme, es sei denn, es werden Pixel-Super-Resolution50,51 (PSR)-Ansätze verwendet, um die effektive Pixelgröße jedes holografischen Rahmens digital zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde PSR nicht verwendet, da unser Gerät als PFU-Detektor fungiert, indem es die räumlich-zeitlichen Veränderungen erfasst, die durch virale Replikationsereignisse hervorgerufen werden, und daher eine Rekonstruktion von Hologrammen mit hoher räumlicher Auflösung (z. B. <1–2 µm) nicht erforderlich war. Tatsächlich haben uns diese Designentscheidungen auch dabei geholfen, die Bildverarbeitungspipeline erheblich zu vereinfachen und zu beschleunigen und unnötige Datenerfassung zu vermeiden. Darüber hinaus könnten die numerischen räumlich-zeitlichen Variationen, die durch PSR-Algorithmen als Funktion der Inkubationszeit eingeführt werden könnten, technische Herausforderungen für das Lernen der neuronalen Netze des PFU-Klassifikators mit sich gebracht haben, was eine weitere Entwurfsüberlegung ist, die wir zusätzlich zu den Überlegungen hatten Vereinfachung der holographischen Datenerfassung, -verarbeitung und -speicherung.

Das Sichtfeld des CMOS-Bildsensors beträgt ca. 0,3 cm2 und daher ist ein mechanisches Scannen erforderlich, um die gesamte Fläche einer Sechs-Well-Platte abzubilden. Eine Scanplattform wurde aus einem Paar linearer Translationsschienen, einem Paar linearer Lagerstangen und linearen Lagern gebaut. Als Hilfsmittel für Gehäuse und Gelenke kamen auch dreidimensional gedruckte Teile zum Einsatz. Zwei Schrittmotoren (Produktnummer 1124090, Kysan Electronics), angetrieben von zwei Treiberchips (DRV8834, Pololu), wurden genutzt, um dem CMOS-Sensor die Durchführung einer zweidimensionalen horizontalen Bewegung zu ermöglichen. Dieses kostengünstige System bewegt den CMOS-Sensor in einem Rastermuster und bildet insgesamt 420 Hologramme (21 horizontal und 20 vertikal, mit 15 % Überlappung) in ca. 3 Minuten ab, um den gesamten Probenscan abzuschließen (Zusatzvideo 1).

Der ausgewählte CMOS-Sensor könnte sich während seines Betriebs auf über 70 °C erwärmen, was das Wachstum der Probe stören und die Agaroseschicht verdampfen lassen könnte, insbesondere in Bereichen, die sich zwischen aufeinanderfolgenden holografischen Scans in der Nähe der Parkposition des Sensors befinden. Daher wurde ein Kühlsystem mit Lüftern (QYN1225BMG-A2, Qirssyn) gebaut. Außerdem versiegelten wir die Seiten der Probe mit Parafilm (Produktnummer 13-374-16, Fisher Scientific) und öffneten vier Löcher in der oberen Abdeckung, um ein sanftes Belüftungssystem zu schaffen, das eine kostengünstige und einfach zu implementierende Lösung darstellt, die vermieden werden kann Probentrocknung.

Ein Mikrocontroller (Arduino Micro, Arduino LLC) wurde zur Steuerung der beiden Schrittmotor-Treiberchips, des Beleuchtungstreiberchips und eines auf Feldeffekttransistoren basierenden digitalen Schalters (zum Ein- und Ausschalten des CMOS-Sensors) verwendet. Alle diese Chips waren zusammen mit dem digitalen Schalter, den Kabeln und den Kondensatoren auf einer Leiterplatte integriert und wurden über ein 6-V-1-A-Netzteil mit Strom versorgt, das an die Steckdose angeschlossen war.

Mit der Programmiersprache C++ wurde ein automatisches Steuerungsprogramm mit grafischer Benutzeroberfläche (Ergänzung Abb. 13) entwickelt. Es kann verwendet werden, um die Bildaufnahmeparameter (z. B. Belichtungszeit usw.) des CMOS-Bildsensors anzupassen und mit dem Mikrocontroller zu kommunizieren, um die Laserdioden oder den CMOS-Sensor weiter ein- und auszuschalten und die Bewegung der mechanischen Abtastung zu steuern System.

Alle Komponenten und ihre Stückpreise sind auch in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die Kosten für die Teile dieses gesamten Bildgebungssystems betragen weniger als 880 US-Dollar, ohne den Laptop. Bei höheren Fertigungsmengen können diese Kosten weiter gesenkt werden.

Nach der Bildaufnahme für jedes Zeitintervall wurden die Rohhologramme zunächst mithilfe des Winkelspektrumansatzes auf Basis der Rückausbreitung49,52,53,54,55 rekonstruiert. Der genaue Abstand zwischen Probe und Sensor wurde im zentralen Bereich jeder Vertiefung mithilfe eines Autofokussierungsalgorithmus basierend auf der Tamura-Gradienten-Metrik56 geschätzt. Für die gesamte Vertiefung wurde der gleiche Abstand zwischen Probe und Sensor verwendet, da die auf einem neuronalen Netzwerk basierende Methode eine Defokussierung tolerieren kann. Anschließend wurde der Phasenkanal der rekonstruierten Hologramme mithilfe einer korrelationsbasierten Methode und linearer Mischung in das gesamte FOV-Bild eingefügt32.

Ab dem zweiten Zeitintervall wurde eine zweistufige Bildregistrierung durchgeführt, um die geringe Genauigkeit des mechanischen Scantisches auszugleichen. Zuerst wurde eine grobkorrelationsbasierte Bildregistrierung des gesamten FOV durchgeführt; Anschließend folgte eine lokale feine elastische Bildregistrierung57. Die Auswirkungen dieser zweistufigen Bildregistrierung werden im Zusatzvideo 2 gezeigt.

Zunächst wurde jeder aktuelle Frame mit den vorherigen drei Frames gestapelt (dargestellt in der ergänzenden Abbildung 14a) und ein Hintergrundbild (dargestellt in der ergänzenden Abbildung 14b) wurde durch Singulärwertzerlegung geschätzt58. Durch Subtrahieren dieses Hintergrundbilds wurden Signale aus den statischen Bereichen unterdrückt (siehe ergänzende Abbildung 14c). Anschließend wurden durch die Anwendung bilateraler Filterung die PFU-Regionen mit Merkmalen hoher Ortsfrequenz weiter verbessert (siehe ergänzende Abbildung 14d).

Aus drei Experimenten wurden insgesamt 93 Bildfelder (256 × 256 Pixel) in PFU-Regionen und 93 Bildfelder aus Nicht-PFU-Regionen manuell zugeschnitten. Jedes Pixel dieser Bildfelder wurde für die PFU-Region mit 1 und für die Nicht-PFU-Region mit 0 gekennzeichnet. Mithilfe dieses Datensatzes wurde ein pixelweiser Naive-Bayes-Klassifikator trainiert, wobei die Tamura-Gradienten-Metrik56 auf den Downsampling-Skalen 2×, 4×, 8×, 16× und 32× berechnet wurde, um als manuell ausgewählte Merkmale zu dienen. Die Wirkung dieses Klassifikators ist in der ergänzenden Abbildung 14e dargestellt. Schließlich werden die PFU-Regionen durch Anwendung mehrerer morphologischer Operationen (z. B. Bild schließen, Bild füllen usw.) grob lokalisiert (siehe ergänzende Abbildung 14f).

Obwohl dieser grobe PFU-Lokalisierungsalgorithmus immer noch dazu neigte, falsch positive Ergebnisse zu erkennen (siehe ergänzende Abbildung 14g), könnte er den Aufwand für das Auffüllen des Netzwerktrainingsdatensatzes erheblich vereinfachen. Darüber hinaus würde die Anwendung dieses Algorithmus auf eine negative Vertiefung dazu beitragen, mögliche Fehlalarme während des Netzwerktrainings abzugrenzen (siehe ergänzende Abbildung 14h). Es ist wichtig zu beachten, dass dieser PFU-Lokalisierungsalgorithmus nur für die Trainingsdatengenerierung verwendet wurde und nicht in der Blindtestphase verwendet wurde, da seine Funktion darin bestand, den Prozess der Trainingsdatengenerierung effizienter zu gestalten.

Die in unserer Arbeit verwendeten Netzwerk-Trainingsdatensätze wurden durch die Kombination des groben PFU-Lokalisierungsalgorithmus mit menschlicher Kennzeichnung generiert. Um die Trainingsdatensätze für VSV zu erhalten, wurden 54 Trainingsvertiefungen aus neun Platten mit sechs Vertiefungen, die neun negative Kontrollvertiefungen und 45 positive (virusinfizierte) Vertiefungen enthielten, abgebildet und verarbeitet. Für den positiven Trainingsdatensatz wurde nach der Bildvorverarbeitung der grobe PFU-Lokalisierungsalgorithmus auf die nach 12 Stunden Inkubation erhaltenen Bilder angewendet. Aus den 45 positiven Wells wurden durch diesen Prozess automatisch 6.930 VSV-PFU-Kandidaten generiert. Anschließend wurde jeder dieser Kandidaten von vier Experten mithilfe der in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigten benutzerdefinierten grafischen Benutzeroberfläche untersucht. Nur die von allen vier Experten bestätigten PFU-Kandidaten wurden im positiven Trainingsdatensatz gespeichert. Potenziell verpasste PFUs stellen hier kein Problem dar, da es sich lediglich um den Trainingsdatensatz handelt. Letztendlich wurden 357 positive Videos der bestätigten PFUs aufbewahrt und durch Erweiterung im Laufe der Zeit auf 2.594 Videos erweitert. Für den negativen Trainingsdatensatz wurden alle negativen Videos aus den neun Negativkontrollvertiefungen bestückt. Um die Spezifität des Netzwerks zu verbessern, wurde der grobe PFU-Lokalisierungsalgorithmus auch auf die holographischen Bilder angewendet, die nach 12-stündiger Inkubation erhalten wurden. Alle erkannten PFU-Regionen waren in diesem Fall falsch positiv, da sie aus den Vertiefungen der Negativkontrolle stammten. Allerdings könnten solche Regionen einzigartige räumlich-zeitliche Merkmale enthalten, die das PFU-Netzwerk möglicherweise verwirren würden, und wurden daher im negativen Trainingsdatensatz behalten, um wertvolle Trainingsbeispiele für unser tiefes neuronales Netzwerk bereitzustellen. Insgesamt wurden durch diesen Prozess 1.169 solcher Videos gefunden, und der negative Trainingsdatensatz wird durch zufällige Auswahl aus den Negativkontrollvertiefungen weiter auf 3.028 Videos erweitert. Nach der gleichen Methode zur Datensatzgenerierung wurden die Trainingsdatensätze von HSV-1 und EMCV, die für das Transferlernen verwendet wurden, entsprechend vorbereitet. Der oben erwähnte grobe PFU-Lokalisierungsalgorithmus wurde zuerst auf holographische 72-Stunden-Phasenbilder für HSV-1 und holographische 60-Stunden-Phasenbilder für EMCV angewendet. Für den HSV-1-Trainingsdatensatz wurden 1.058 positive Videos von 122 bestätigten HSV-1-PFUs aus zehn Wells und 1.453 negative Videos aus zwei negativen Kontrollwells generiert. Ebenso bildeten 776 positive Videos von 152 EMCV-PFUs aus 15 Wells und 1.875 negative Videos aus drei Negativkontrollwells den Trainingsdatensatz für EMCV. Basierend auf der Plaquebildungsgeschwindigkeit für jeden Virustyp wurden die Zeitintervalle zwischen zwei aufeinanderfolgenden holografischen Bildern für die VSV-Videos, HSV-1-Videos und EMCV-Videos auf 1 Stunde, 2 Stunden bzw. 1 Stunde eingestellt.

Unser PFU-Klassifikatornetzwerk wurde auf der Grundlage der DenseNet59-Struktur aufgebaut, wobei 2D-Faltungsschichten durch die Pseudo-3D-Bausteine60 ersetzt wurden. Die detaillierte Architektur ist in der ergänzenden Abbildung 15 dargestellt und in der ergänzenden Anmerkung 3 beschrieben. Als Aktivierungsfunktion haben wir eine gleichgerichtete lineare Einheit verwendet. Im Training wurden Batch-Normalisierung und Dropout mit einer Rate von 0,5 verwendet. Die von uns verwendete Verlustfunktion war der gewichtete Kreuzentropieverlust:

Dabei ist p die Netzwerkausgabe, also die Wahrscheinlichkeit jeder Klasse (d. h. PFU oder Nicht-PFU) vor der SoftMax-Schicht, g das Ground-Truth-Label (das für die binäre Klassifizierung gleich 0 oder 1 ist), K ist die Gesamtzahl der Trainingsproben in einem Batch und w ist die jeder Klasse zugewiesene Gewichtung, definiert als w = 1 − d, wobei d der Prozentsatz der Proben in einer Klasse ist (d = 46,1 % für positive Klasse, d = 53,9 % für die negative Klasse).

Die eingegebenen Vier-Frame-Videos wurden als Tensor mit der Dimension 1 × 4 × 480 × 480 (Kanal × Zeitrahmen × Höhe × Breite) formatiert. Beim Laden des Trainingsdatensatzes wurden Datenerweiterungen wie Spiegeln und Drehen angewendet. Das Netzwerkmodell wurde mit dem Adam-Optimierer mit einem Impulskoeffizienten von (0,9, 0,999) optimiert. Die Lernrate betrug zu Beginn 1 × 10−4, und ein Planer wurde verwendet, um die Lernrate alle 30 Epochen mit einem Koeffizienten von 0,7 zu ​​verringern. Unser Modell wurde für 264 Epochen mit der Nvidia GeForce RTX3090-GPU mit einer Stapelgröße von 30 trainiert. Die Verlustkurve, die Trainingsempfindlichkeit und die Spezifitätskurven unseres Trainingsprozesses sind in der ergänzenden Abbildung 16 dargestellt. In diesen Kurven sind 10 % des Trainingsdatensatzes enthalten wurde zufällig als Validierungsdatensatz ausgewählt. Beachten Sie, dass die Trainings- und Validierungsdatensätze (die holografische Videos der Bohrlöcher enthalten) aus verschiedenen Bohrlöchern zu unterschiedlichen Zeitpunkten jedes PFU-Assays erstellt wurden, wie zuvor beschrieben; Daher spiegeln diese Sensitivitäts- und Spezifitätskurven für Training und Validierung nicht die Bewertung einer einzelnen Testvertiefung wider, die ab Beginn der Inkubation regelmäßig überwacht wird. Unsere unter „Ergebnisse“ angegebenen Blindtestergebnisse wurden jedoch mithilfe des trainierten neuronalen VSV-PFU-Erkennungsnetzwerks an einzelnen Testvertiefungen erfasst, die ab Beginn der Inkubation mit einer Probenahmeperiode von 1 Stunde kontinuierlich überwacht wurden, wodurch eine Erkennung von >90 % erreicht wurde Rate für VSV-PFUs mit 100 % Spezifität in <20 Stunden.

In ähnlicher Weise haben wir die neuronalen Netze zur PFU-Erkennung für HSV-1 und EMCV durch Transferlernen aufgebaut, wobei dieselbe neuronale Netzarchitektur verwendet wurde, jedoch mit den Parametern initialisiert wurde, die durch das zuvor trainierte VSV-Modell erhalten wurden. Andere Trainingseinstellungen für HSV-1- und EMCV-Modelle, wie etwa die Verlustfunktion, die anfängliche Lernrate und der Optimierer, wurden alle mit denen des VSV-Modells beibehalten, die Lernrate wurde jedoch alle zehn Epochen um einen Koeffizienten von 0,8 verringert. Schließlich wurden die HSV-1- und EMCV-Modelle basierend auf dem Validierungsverlust nach 135 bzw. 88 Trainingsepochen erhalten.

Nach Erhalt der PFU-Wahrscheinlichkeitskarte und Anwendung des Schwellenwerts von 0,5 wurden zwei Bildnachbearbeitungsschritte durchgeführt, um das endgültige PFU-Erkennungsergebnis zu erhalten: (1) maximale Wahrscheinlichkeitsprojektion über die Zeit und (2) PFU-Größenschwellenwert. Die maximale Projektion wurde verwendet, um die niedrigeren PFU-Wahrscheinlichkeitswerte zu kompensieren, die vom PFU-Zentrum generiert werden, wenn es in die späte Phase seines Wachstums eintritt. Die Auswirkung dieser maximalen Projektion ist in der ergänzenden Abbildung 17 dargestellt. Der Größenschwellenwert auf der PFU-Wahrscheinlichkeitskarte wurde auf 0,5 × 0,5 mm2 festgelegt.

Nachdem die binäre PFU-Erkennungsmaske für jede Testvertiefung erhalten wurde, wurde ein automatisierter PFU-Zählalgorithmus entwickelt, der sowohl mit spärlichen als auch mit dichten Virusproben kompatibel ist. Zunächst wurden die verbundenen Komponenten in der Erkennungsmaske zur m-ten Stunde (bezeichnet als Dm) gefunden. Anschließend wurden die PFU-Zahlen für jede verbundene Komponente in Dm berechnet, indem die maximale Anzahl verbundener Komponenten genommen wurde, die in dieser Region im Laufe der Zeit entstanden sind:

wobei * die elementweise Multiplikationsoperation bezeichnet, ncc die PFU-Anzahl für die untersuchte verbundene Komponente in Dm bezeichnet, Dt die PFU-Erkennungsmaske zur t-ten Stunde bezeichnet, C eine Binärkarte (mit den gleichen Abmessungen wie Dt) darstellt, die nur verwaltet die aktuell untersuchte verbundene Komponente in Dm als 1, und H(·) bezieht sich auf die Operation, bei der die Anzahl der verbundenen Komponenten ermittelt wird. Schließlich wurde die Summe der NCC für alle angeschlossenen Komponenten in Dm als endgültige PFU-Anzahl für jede Vertiefung verwendet.

Zum Vergleich mit unserem Gerät wurden einige der VSV-Platten mit sechs Vertiefungen mit dem BioTek Cytation 5 (Agilent Technologies) im Hellfeldmodus mit einer Objektivlinse von 4×, 0,13 NA analysiert. Diese aufgenommenen Bilder wurden mit der eigenständigen Gen5 Image Prime-Software (Agilent Technologies) verarbeitet und analysiert. Die erfassten lokalen Bilder wurden zunächst zu einem gesamten FOV-Bild jeder Testvertiefung zusammengefügt, das dann mit der Funktion „Digitaler Phasenkontrast“ unter Verwendung eines 50 μm großen Strukturierungselements verarbeitet wurde. Als nächstes wurde das Tool „Zellanalyse“ verwendet, um die automatisierte PFU-Zählung durchzuführen. In den Grundeinstellungen wurde ein Intensitätsschwellenwert von 2.500 und ein Objektgrößenschwellenwert von 1.500–5.000 µm verwendet. In den erweiterten Erkennungseinstellungen wurden der Rolling-Ball-Durchmesser der Hintergrundabflachung, die Bildglättungsstärke und der bewertete Hintergrundpegel auf 1.000 µm, 20 Zyklen eines 3 × 3-Durchschnittsfilters bzw. 30 % der niedrigsten Pixel eingestellt. Alle für die Vorverarbeitung und die automatische PFU-Zählung verwendeten Parameter wurden in Absprache mit dem technischen Support-Team von Agilent Technologies optimiert.

Um die PFU-Erkennungsleistung unseres Geräts zu bewerten, wurden die Erkennungsrate und die Falscherkennungsrate wie folgt definiert:

Dabei stellt TP (True Positives) die Anzahl der von unserem Gerät zu einem bestimmten Zeitpunkt im Inkubator erkannten PFUs dar und GT (Ground Truth) ist die Gesamt-PFU-Anzahl, die von einem Experten für dieselbe Probe nach 48 Stunden VSV-Inkubation gezählt wurde ( 120 Stunden für HSV-1 und 72 Stunden für EMCV), gefolgt von der Standardfärbung als Teil des traditionellen Plaque-Assay-Protokolls. Wir haben auch verwendet:

wobei FP für False Positives steht.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in der Arbeit und ihren ergänzenden Informationen verfügbar sind. Beispielbilder für Tests finden Sie unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7931999. Der vollständige vom Sensor erfasste Rohbilddatensatz (>11 TB) ist auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Die auf den PFU-Klassifikator bezogenen PyTorch-Codes sind unter https://github.com/liyuzhu1998/PFU_Detection_Codes verfügbar. Die CAD-Dateien des Geräts und seine detaillierten Montageanweisungen finden Sie unter https://github.com/liyuzhu1998/PFU_Detection_Hardware.

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Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Tairan Liu, Yuzhu Li.

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, University of California, Los Angeles, CA, USA

Tairan Liu, Yuzhu Li, Hatice Ceylan Koydemir, Yijie Zhang, Ethan Yang, Merve Eryilmaz, Hongda Wang, Jingxi Li, Bijie Bai, Guangdong Ma und Aydogan Ozcan

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California, Los Angeles, USA

Tairan Liu, Yuzhu Li, Yijie Zhang, Merve Eryilmaz, Hongda Wang, Jingxi Li, Bijie Bai und Aydogan Ozcan

California NanoSystems Institute (CNSI), University of California, Los Angeles, CA, USA

Tairan Liu, Yuzhu Li, Yijie Zhang, Hongda Wang, Jingxi Li, Bijie Bai und Aydogan Ozcan

Abteilung für Biomedizintechnik, Texas A&M University, College Station, TX, USA

Hatice Ceylan Koydemir

Zentrum für Remote-Gesundheitstechnologien und -systeme, Texas A&M University, College Station, TX, USA

Hatice Ceylan Koydemir

Fakultät für Mathematik, University of California, Los Angeles, CA, USA

Ethan Yang

Fakultät für Physik, Xi'an Jiaotong Universität, Xi'an, China

Guangdong Ma

Abteilung für Chirurgie, University of California, Los Angeles, CA, USA

Aydogan Ozcan

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AO konzipierte die Forschung. YL, TL, HW und JL bauten das linsenlose Bildgebungssystem. YL, BB und HW entwickelten die Systemsteuerungssoftware. TL, HCK, YZ, ME und YL führten die Experimente durch. YL, TL, EY, GM und YZ verarbeiteten die Daten. TL, YL, HCK, YZ, EY und AO haben das Manuskript erstellt und alle Autoren haben zum Manuskript beigetragen. AO überwachte die Forschung.

Korrespondenz mit Aydogan Ozcan.

AO, YL und TL haben eine anhängige Patentanmeldung (US-Seriennummer 63/356.976) im Zusammenhang mit der in diesem Manuskript beschriebenen Arbeit. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Xueli Chen, Guohai Situ und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Anmerkungen, Tabellen und Abbildungen.

Holographischer Bildgebungsprototyp während seines Betriebs.

Auswirkungen des zweistufigen Bildregistrierungsprozesses.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liu, T., Li, Y., Koydemir, HC et al. Schnelle und fleckenfreie Quantifizierung viraler Plaque mittels linsenloser Holographie und Deep Learning. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01057-7

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Eingegangen: 04. Juli 2022

Angenommen: 14. Mai 2023

Veröffentlicht: 22. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01057-7

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